【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及中藥材深加工，具體是一種酶解法制備鐵皮石斛肽的方法。
技術(shù)介紹
1、鐵皮石斛為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛（dendrobium?officinale?kimura?etmigo）的莖經(jīng)干燥后得到的中藥材，在我國(guó)民間享有“救命仙草”的美譽(yù)。現(xiàn)代藥理研究表明鐵皮石斛具有降血糖、增強(qiáng)免疫力、抗氧化、抗腫瘤和抗衰老等藥理作用。鐵皮石斛葉中富含人體所需的多種蛋白質(zhì)，但是需經(jīng)機(jī)體分解為小分子肽或氨基酸被機(jī)體吸收，才能發(fā)揮鐵皮石斛的藥效。
2、目前，肽類化合物的常用制備方法共有5種，分別是酶解法、化學(xué)合成法、天然提取法、微生物發(fā)酵法和dna重組法。其中酶解法是經(jīng)典方法，也是制取小分子肽的主要方法。但是該方法存在生產(chǎn)效率低下的缺點(diǎn)，而且采用酶解法制備的肽類化合物分子量分布廣泛，導(dǎo)致能夠充分被人體吸收發(fā)揮藥效的小分子肽含量進(jìn)一步下降，產(chǎn)品的生物利用度低。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于避免上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處而提供一種酶解法制備平均分子量在1000d以下、生物利用度高的鐵皮石斛肽。
2、本專利技術(shù)上述目的通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種酶解法制備鐵皮石斛肽的方法，包括以下步驟：
3、步驟一、鐵皮石斛葉于60℃烘箱烘干，干燥石斛葉經(jīng)打粉機(jī)粉碎后過(guò)80目篩，得鐵皮石斛葉粉；
4、步驟二、鐵皮石斛葉粉按照料液比1:25~31加入去離子水，超聲處理10min，加入鐵皮石斛葉粉重量4~8倍的酸性溶液，充分?jǐn)嚢韬罄^續(xù)超聲處理30min，之后3500
5、步驟三、取34~58份魔芋精粉均勻分散于100~180份去離子水中，攪拌至魔芋精粉充分吸水溶脹為魔芋溶膠，加入18~22份苯丙烯醛，攪拌10～20min，再用氫氧化鈉調(diào)整ph值=10.0～11.0，80~90℃水浴保溫3h，靜置冷卻后，再加入30～60份環(huán)己甲醇，40～65℃浸泡處理24小時(shí)，加入16~23份堿性蛋白酶攪拌5~6h，即得固定堿性蛋白酶；
6、步驟四、鐵皮石斛水解液加入固定堿性蛋白酶，所述固定堿性蛋白酶用量為鐵皮石斛水解液重量的0.04~0.08％，酶解2h后，90℃水浴滅酶30min，冷卻后1500~2500rpm離心30min；
7、步驟五、取離心后上清液上分子篩層析柱，用ph=7.2的0.01mol/l磷酸鹽緩沖液洗脫，流速為0.05ml/min，收集鐵皮石斛肽。
8、酸性溶液的制備方法：
9、取4~8份次氯酸磷酸鈉溶于19~32份去離子水中，加入2~6份氯化鉻，70~110℃攪拌1.5h，得到混合物a；取38~43份十六烷基三甲基溴化銨，加入磷酸調(diào)整ph值=5.5～6.8，常溫?cái)嚢杌罨?.5h；然后加入混合物a，超聲混合30min，得到所述酸性溶液。
10、分子篩層析柱的制備方法：
11、1）、取4~6份亞甲雙壬基酚聚氧乙烯醚，加入30~40份去離子水和8~11份2mol/lhcl，攪拌溶解后，加入8.5~10份亞磷酸三苯酯，攪拌5~8h后，95℃烘干1d，在480c空氣氣氛中焙燒6h，得到分子篩前體；
12、2）、分子篩前體中加入46~57份2-苯基丙基三氯硅烷質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的甲苯溶液和5~9份對(duì)硝基-n，n-二甲基苯胺，60℃攪拌20h，冷卻后1500~3000r/min離心15min，沉淀用去離子水洗滌后真空干燥48h得到分子篩；
13、3）、分子篩經(jīng)ph=7.2的0.01mol/l磷酸鹽緩沖液浸泡5~8h后，裝入層析柱中，用上述磷酸鹽緩沖液平衡后即得所述分子篩層析柱。
14、本專利技術(shù)具有以下有益效果：
15、（1）、表面活性劑可以通過(guò)疏水作用與木質(zhì)素結(jié)合，進(jìn)而促進(jìn)酶解效率。本專利技術(shù)技術(shù)方案對(duì)十六烷基三甲基溴化銨進(jìn)行改性，使改性表面活性劑分子與鐵皮石斛水解蛋白間存在更多氫鍵作用位點(diǎn)，相比一般的表面活性劑，能夠與鐵皮石斛水解蛋白的疏水內(nèi)腔形成穩(wěn)定結(jié)合的化學(xué)鍵，使水解蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中的有序α-螺旋結(jié)構(gòu)向無(wú)規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化，水解蛋白微觀表面完整性被破壞，大量小球形顆粒附著于大顆粒上，顆粒變的疏松。鐵皮石斛蛋白致密的球狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，比表面積增加。由于表面的孔隙和小顆粒數(shù)量的增加，在酶解過(guò)程中鐵皮石斛蛋白作為底物與水解酶接觸的表面積增加，使其酶解效率提高。此外，孔隙結(jié)構(gòu)也有利于水解酶進(jìn)入底物顆粒內(nèi)部，使肽鍵斷裂，產(chǎn)生更多小分子肽。
16、（2）、本專利技術(shù)技術(shù)方案通過(guò)酸性溶液先大量去除溶液中的半纖維素，再通過(guò)其中的改性表面活性劑吸附殘留的木質(zhì)素，避免木質(zhì)素對(duì)酶的無(wú)效吸附，減弱溶液中木質(zhì)素對(duì)酶解的影響，從而可以縮短酶解時(shí)間，節(jié)省酶的用量，從而降低酶解成本，提高生產(chǎn)可行性。可顯著縮短酶解時(shí)間，提高酶解效率，同時(shí)有效降低纖維素酶用量。
17、（3）、以多糖作為載體偶聯(lián)制備的堿性蛋白酶，具有較好的催化活力和使用穩(wěn)定性，但是由于體系中鐵皮石斛蛋白致密的球狀結(jié)構(gòu)被打開(kāi)，比表面積增加，在酶解過(guò)程中，顆粒狀多孔的鐵皮石斛蛋白容易出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，采用常規(guī)方法制備的固定化酶的會(huì)導(dǎo)致體系中膠團(tuán)聚集數(shù)的增加，膠團(tuán)內(nèi)部容積增大，使反應(yīng)底物更難靠近堿性蛋白酶，阻礙界面層上反應(yīng)底物與酶的反應(yīng)。
18、（4）、通過(guò)特定的工藝方法在魔芋多糖載體表面引入雙鍵，載體表面發(fā)生聚合反應(yīng)，聚合物長(zhǎng)鏈之間構(gòu)建了柔性交聯(lián)橋，形成了交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，為顆粒狀多孔蛋白的吸附捕獲提供了合適的孔隙和相互連接的通道，實(shí)現(xiàn)了對(duì)鐵皮石斛顆粒狀多孔蛋白的高效吸附，將堿性蛋白酶負(fù)載在改性魔芋多糖載體表面，再將負(fù)載有堿性蛋白酶的載體分散在體系中實(shí)現(xiàn)酶解反應(yīng)生產(chǎn)小分子肽。當(dāng)堿性蛋白酶負(fù)載在改性魔芋多糖載體表面后，驅(qū)動(dòng)了顆粒狀多孔的鐵皮石斛蛋優(yōu)先與改性魔芋多糖載體表面的堿性蛋白酶形成團(tuán)聚，為酶解反應(yīng)提供了一種以酶團(tuán)聚體為中心的微環(huán)境，避免了鐵皮石斛蛋白團(tuán)聚導(dǎo)致酶解不充分的問(wèn)題，提高產(chǎn)物收率。
19、（5）、分子量小于1000的鐵皮石斛肽具有較好的活性，并利于人體吸收，常規(guī)分離方式分離出鐵皮石斛肽由于分子量分布范圍較寬，生物活性較差，且酶解后的混合物中存在結(jié)構(gòu)及物化性質(zhì)相近的化合物，分離純化難度極大，常規(guī)的柱層析對(duì)天然活性物質(zhì)的分離選擇性低，本專利技術(shù)技術(shù)方案制備的層析柱中分子篩表面引入了帶負(fù)電荷的基團(tuán)，調(diào)控分子篩與小分子肽間的相互作用方式及作用強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)分離過(guò)程中對(duì)酶解后的混合物中結(jié)構(gòu)及物化性質(zhì)微小差異的分子識(shí)別，能夠集中分離出分子量較小的鐵皮石斛小分子肽，提高產(chǎn)品的生物活性。
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1.一種酶解法制備鐵皮石斛肽的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的酶解法制備鐵皮石斛肽的方法，其特征在于：步驟二中，所述超聲處理的條件為功率150~300W，頻率50~75kHz。
3.如權(quán)利要求1所述的酶解法制備鐵皮石斛肽的方法，其特征在于：步驟二中，所述酸性溶液的制備方法：
4.如權(quán)利要求1所述的酶解法制備鐵皮石斛肽的方法，其特征在于：步驟四中，固定堿性蛋白酶的加入量為鐵皮石斛水解液重量的0.04~0.08％。
5.如權(quán)利要求1所述的酶解法制備鐵皮石斛肽的方法，其特征在于：步驟五中，所述分子篩層析柱的制備方法：
【技術(shù)特征摘要】
1.一種酶解法制備鐵皮石斛肽的方法，其特征在于：包括以下步驟：
2.如權(quán)利要求1所述的酶解法制備鐵皮石斛肽的方法，其特征在于：步驟二中，所述超聲處理的條件為功率150~300w，頻率50~75khz。
3.如權(quán)利要求1所述的酶解法制備鐵皮石斛肽的方法，其特征在于：步驟二...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳福祥，王國(guó)鑫，王品凱，宋喜紅，吳俊穎，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江西軒斛軒健康科技有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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