【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物制藥和核酸疫苗。更具體地，本專利技術涉及rsvmrna疫苗及其制備方法和應用。
技術介紹
1、呼吸道合胞病毒(rsv)屬于副黏病毒科，肺炎病毒亞科的肺炎病毒屬，其基因組為單股負鏈rna，全長15.2kb，編碼11個蛋白質，其中粘附蛋白(g)和融合蛋白(f)是病毒表面的主要糖蛋白，也是介導病毒感染人體細胞最關鍵的蛋白。rsv只有一個血清型，分為a、b兩個亞型，國際上根據g基因的基因變異又將rsv分類為不同基因型，目前a亞型的on1基因型和b亞型的ba9基因型是全球流行的優勢基因型，也是我國近年流行的主要基因型。
2、rsv可以引起全年齡段人群的呼吸道感染，其中兒童、老人，以及存在免疫缺陷或基礎疾病的成年人群尤其易感。rsv感染后的臨床表現差異較大，可能是癥狀輕微的呼吸道感染，也可能是急性下呼吸道感染，重癥感染還會累及呼吸系統以外的臟器，此外，在生命早期感染rsv的兒童后續有發生反復喘息和氣道高反應的風險。因此，開發針對rsv的疫苗或藥物具有重要意義。
3、人們對rsv疫苗的探索始于19世紀60年代，很長一段時間內，無論是滅活rsv疫苗還是重組蛋白rsv疫苗，效果都差強人意。直到人們破譯了rsv感染人體細胞時的結構變異，認識到f蛋白的融合前構象(pref)才是引發人體產生針對rsv免疫應答的主要因素，此后的rsv疫苗均以pref蛋白為抗原，并取得了較好的效果。
4、由脂質納米粒(lnps)包裹的體外轉錄的mrnas組成的核酸疫苗可以引發強烈的體液和細胞免疫反應。通過lnp遞送mr
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一種呼吸道合胞病毒mrna疫苗，其包含編碼呼吸道合胞病毒on1基因型f蛋白和ba9基因型f蛋白部分片段的mrna抗原分子，其能有效防治rsv感染。
2、本專利技術提供了一種編碼呼吸道合胞病毒(rsv)蛋白的mrna分子，包含編碼rsv?on1基因型f蛋白部分片段和ba9基因型f蛋白部分片段的抗原序列。
3、在一個實施例中，所述編碼rsv?on1基因型f蛋白部分片段和ba9基因型f蛋白部分片段的序列的末端分別拼接有編碼t4?foldon結構的序列，或所述編碼rsv?on1基因型f蛋白部分片段和ba9基因型f蛋白部分片段的序列末端分別拼接有編碼人igg1的fc序列。
4、在一個實施例中，所述包含編碼呼吸道合胞病毒on1基因型f蛋白部分片段的抗原序列如seq?id?no.3、5或7所示核苷酸序列所編碼，包含編碼呼吸道合胞病毒ba9基因型f蛋白部分片段的抗原序列如seq?id?no.4、6或8所示核苷酸序列所編碼。
5、在一個實施例中，所述mrna分子還包括帽結構，5′utr，3′utr和poly?a；所述5′utr選自cyba、den2、hhbb、rpl38、rps25、tcv或top；所述3′utr選自hhba1、hhbb、bydv、hhbbx2、cyba_1.5x、bmv、tsv或tcv；所述poly?a選自60a、100a、30a-10x-70a、30a-10x-70a-10c-a或40a-10x-60a-10c-a。優選地，所述5’utr為den2，所述3’utr為hhbbx2，所述poly?a為100a。
6、本專利技術還提供了一種所述mrna分子的表達載體，其包含從5′端至3′端的以下元件：5’utr、包含rsv?f蛋白部分片段的編碼序列、3’utr和poly?a；任選地，是將上述包含rsvf蛋白部分片段的編碼序列連接至pkl質粒中，優選地，所述pkl質粒是seq?id?no.2的pkl-luci質粒酶切得到的。
7、在一個實施例中，所述mrna分子的表達載體的5’utr選自cyba、den2、hhbb、rpl38、rps25、tcv或top；所述3’utr選自hhba1、hhbb、bydv、hhbbx2、cyba_1.5x、bmv、tsv或tcv；所述poly?a選自60a、100a、30a-10x-70a、30a-10x-70a-10c-a或40a-10x-60a-10c-a。
8、在一個實施例中，所述呼吸道合胞病毒mrna疫苗包含上述的mrna分子。
9、在一個實施例中，所述呼吸道合胞病毒mrna疫苗還包含脂質納米顆粒(lnp)，脂質納米顆粒包封所述mrna分子。優選的，所述lnp包含d-lin-mc3-dma、dspc、膽固醇和dmg-peg2000，其摩爾比為50:10:38.5:1.5。優選的，所述脂質納米顆粒與mrna的氮磷比為(4～8):1(脂質納米顆粒與mrna的氮磷比指的是：脂質納米顆粒中陽離子脂質的氮元素與mrna分子的磷元素的摩爾比)。
10、在一個實施例中，lnp包封的mrna分子為分別編碼包含rsv?on1基因型f蛋白部分片段和包含ba9基因型f蛋白部分片段的mrna分子的混合，其中編碼包含rsv?on1基因型f蛋白部分片段和包含ba9基因型f蛋白部分片段的mrna分子的摩爾比為(0.5～4):1。
11、本專利技術還提供了所述的mrna分子、所述的表達載體、所述的呼吸道合胞病毒mrna疫苗在制備預防和/或治療呼吸道合胞病毒感染的藥物中的應用。優選地，所述疾病包括但不限于癥狀輕微的呼吸道感染、急性下呼吸道感染、重癥感染累及呼吸系統以外的臟器、生命早期感染rsv導致的兒童后續發生反復喘息和氣道高反應。
12、本專利技術的有益效果：
13、本專利技術設計并制備了一款呼吸道合胞病毒mrna疫苗，該疫苗包含rsv?on1基因型和ba9基因型的f蛋白部分片段的抗原mrna分子，通過結構改造使兩條mrna均編碼pref蛋白或含有pref蛋白主要抗原表位的蛋白質。小鼠免疫試驗證實，本專利技術的呼吸道合胞病毒mrna疫苗能有效誘導小鼠體內針對rsv的體液免疫和細胞免疫。
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1.一種編碼呼吸道合胞病毒（RSV）蛋白的mRNA分子，其特征在于，包含編碼RSV?ON1基因型F蛋白部分片段和BA9基因型F蛋白部分片段的抗原序列。
2.根據權利要求1所述的編碼呼吸道合胞病毒蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述編碼RSV?ON1基因型F蛋白部分片段和BA9基因型F蛋白部分片段的序列的末端分別拼接有編碼T4?foldon結構的序列，或所述編碼RSV?ON1基因型F蛋白部分片段和BA9基因型F蛋白部分片段的序列末端分別拼接有編碼人IgG1的Fc序列。
3.根據權利要求2所述的編碼呼吸道合胞病毒蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述包含編碼RSV?ON1基因型F蛋白部分片段的抗原序列如SEQ?ID?NO.3、5或7所示核苷酸序列所編碼，包含編碼RSV?BA9基因型F蛋白部分片段的抗原序列如SEQ?ID?NO.4、6或8所示核苷酸序列所編碼。
4.根據權利要求1-3任一項所述的編碼呼吸道合胞病毒蛋白的mRNA分子，其特征在于，所述mRNA分子還包括帽結構，5′UTR元件，3′UTR元件和poly?A；所述5′UTR選自CYBA、DEN
5.包含權利要求1-4任一項所述mRNA分子的表達載體，其特征在于，其包含從5′端至3′端的以下元件：5’UTR、包含RSV?F蛋白部分片段的編碼序列、3’UTR和poly?A；任選地，是將上述包含RSV?F蛋白部分片段的編碼序列連接至pKL質粒中，優選地，所述pKL質粒是SEQ?IDNO.2的pKL-Luci質粒酶切得到的。
6.權利要求5所述的表達載體，其特征在于，所述5’UTR選自CYBA、DEN2、hHBB、RpL38、RpS25、TCV或TOP；所述3’UTR選自hHBA1、hHBB、BYDV、hHBBx2、CYBA_1.5x、BMV、TSV或TCV；所述poly?A選自60A、100A、30A-10X-70A、30A-10X-70A-10C-A或40A-10X-60A-10C-A。
7.一種呼吸道合胞病毒mRNA疫苗，其特征在于，包含權利要求1-4任一所述的mRNA分子。
8.根據權利要求7所述的呼吸道合胞病毒mRNA疫苗，其特征在于，所述mRNA疫苗還包含脂質納米顆粒，脂質納米顆粒包封所述mRNA分子。
9.權利要求7-8所述的呼吸道合胞病毒mRNA疫苗，其特征在于，所述脂質納米顆粒包封的mRNA分子為分別編碼包含RSV?ON1基因型F蛋白部分片段和包含BA9基因型F蛋白部分片段的mRNA分子的混合，其中編碼包含RSV?ON1基因型F蛋白部分片段和包含BA9基因型F蛋白部分片段的mRNA分子的摩爾比為（0.5~4）:1。
10.權利要求1-4任一所述的mRNA分子、權利要求5或6所述的表達載體、權利要求7-9任一項所述的mRNA疫苗在制備治療呼吸道合胞病毒感染相關疾病的藥物中的應用，所述疾病包括但不限于癥狀輕微的呼吸道感染、急性下呼吸道感染、重癥感染累及呼吸系統以外的臟器、生命早期感染RSV導致的兒童后續發生反復喘息和氣道高反應。
...【技術特征摘要】
1.一種編碼呼吸道合胞病毒（rsv）蛋白的mrna分子，其特征在于，包含編碼rsv?on1基因型f蛋白部分片段和ba9基因型f蛋白部分片段的抗原序列。
2.根據權利要求1所述的編碼呼吸道合胞病毒蛋白的mrna分子，其特征在于，所述編碼rsv?on1基因型f蛋白部分片段和ba9基因型f蛋白部分片段的序列的末端分別拼接有編碼t4?foldon結構的序列，或所述編碼rsv?on1基因型f蛋白部分片段和ba9基因型f蛋白部分片段的序列末端分別拼接有編碼人igg1的fc序列。
3.根據權利要求2所述的編碼呼吸道合胞病毒蛋白的mrna分子，其特征在于，所述包含編碼rsv?on1基因型f蛋白部分片段的抗原序列如seq?id?no.3、5或7所示核苷酸序列所編碼，包含編碼rsv?ba9基因型f蛋白部分片段的抗原序列如seq?id?no.4、6或8所示核苷酸序列所編碼。
4.根據權利要求1-3任一項所述的編碼呼吸道合胞病毒蛋白的mrna分子，其特征在于，所述mrna分子還包括帽結構，5′utr元件，3′utr元件和poly?a；所述5′utr選自cyba、den2、hhbb、rpl38、rps25、tcv或top；所述3′utr選自hhba1、hhbb、bydv、hhbbx2、cyba_1.5x、bmv、tsv或tcv；所述poly?a選自60a、100a、30a-10x-70a、30a-10x-70a-10c-a或40a-10x-60a-10c-a；優選地，所述5’utr為den2；所述3’utr為hhbbx2，所述poly?a為100a。
5.包含權利要求1-4任一項所述mrna分子的表達載體，其特征在于，其包含從5′端至3′端的以下元件：5’utr、包含...
【專利技術屬性】
技術研發人員：楊建國，吳依昕，李文華，王雪，叢麗圓，王艷，姜濤，陰雅潔，蔣敦泉，劉永江，
申請(專利權)人：北京康樂衛士生物技術股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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