【技術實現步驟摘要】
本申請涉及生物技術，具體涉及一種嵌合體文庫構建的引物組合及方法和應用。
技術介紹
1、嵌合體(mosaicism)是指當一個人身體內擁有兩種或兩種以上染色體組成的不同細胞系的時候，稱之為嵌合體。其既可能發生在染色體層面，也可能發生在基因水平。而且其分布有多種模式，既可能全身分布，也可能局限在某個組織的分布。其類型包括體細胞嵌合、生殖細胞和體細胞均發生嵌合、生殖細胞嵌合的情況。其中生殖腺嵌合(gonadal/germline?mosaicism)是指一個個體的生殖腺細胞不是純合的而是嵌合體。生殖腺嵌合產生的一個常見原因是異源嵌合體，即兩個精子分別與兩個卵細胞受精后發生了融合，結果導致該個體的生殖腺成為由兩種不同基因型的細胞群組成的嵌合體；另外，生殖腺細胞突變也可導致生殖腺嵌合的產生，即在胚胎發育過程中，某個未來的生殖腺細胞發生突變，結果導致該個體的生殖腺細胞成為嵌合體。
2、生殖腺嵌合在遺傳病中是一個很重要的問題，通常是除生殖腺以外的其他組織都沒有發生改變，其本身通常不發病，外周血的dna檢測無法檢出相應的基因異常，但是產生的配子有正常和異常2種，當子代獲得異常配子，尤其是男性，就會發病。在臨床上，一些罕見病患兒，尤其是顯性遺傳病和性染色體遺傳病患兒，通過基因檢測發現了明確的致病突變，但驗證父母時，父母卻不攜帶致病突變。這種情況是新發突變還是生殖腺嵌合體。就目前的現狀，一般這種情況認為是新發突變。但假如有害突變以嵌合的方式存在于性腺中，從父母的外周血dna中是無法檢測到基因突變信息的，但卻極有可能生育出患病后代，風險可
3、目前可用于嵌合體檢測的技術有sanger測序、單分子倒置探針技術(single-molecule?molecular?inversion?probes)、微滴式數字pcr技術(ddpcr)以及靶向捕獲結合高通量測序。sanger測序通過利用特異引物對目標片段進行pcr富集，對pcr富集產物進行sanger測序，但sanger測序檢測靈敏度只有10％-15％，如果低于這個檢測范圍，則存在漏檢的風險，即使在sanger測序圖譜上分析出疑是嵌合，但卻無法確定嵌合比例；單分子倒置探針技術雖能去除偏差和pcr擴增帶來的冗余序列，保留原始樣本中真實的信息，能檢測到maf≤1％的低頻率變異，但是在捕獲目標序列的過程中，受目標序列長度空間效應的影響，會對實驗結果產生影響，而且實驗周期長，成本高。此外，對于一些位點如高gc含量區，目前難以有效設計探針，因而捕獲效率較差。ddpcr可對絕大部分嵌合突變進行驗證及定量分析，但對引物的特異性要求極高，需要多次進行引物篩選和體系優化。靶序列捕獲結合超高深度測序，可將檢測靈敏度較常規一代測序技術放大至少1000倍，但該方法需先對目標位點上下游若干序列進行靶向富集，在對靶向富集產物片段化文庫構建，使檢測周期延長，檢測成本升高；而且靶向富集和文庫富集都需要pcr擴增，無形中引入錯誤的風險大大提高，對嵌合比例的判斷，造成極大的干擾；與此同時，如果變異位點富含高gc，在進行靶向富集時，需要添加甜菜堿、二甲基亞砜等增強劑，不斷優化擴增體系，使檢測變得復雜；此外，該方法嵌合體檢測也難以有效檢測cnv嵌合體。
4、亟需有一種新的能夠既簡單、高效、低成本，又可解決高gc區域，同時還可以檢測cnv嵌合體的方法及產品。
技術實現思路
1、基于此，本申請一實施方式有必要提供一種嵌合體文庫構建的引物組合，采用該引物組合，只需要一步pcr擴增，快速建庫，縮短了建庫的時間，降低了檢測成本，提高了檢測效率，同時，能夠準確實現高gc含量區域snvs、indels和cnv嵌合檢測。
2、技術方案包括如下：
3、嵌合體文庫構建的引物組合，所述引物組合中，
4、上游引物的序列由5’端到3’端包括第一通用引物序列和根據靶標設計的特異性上游引物序列；
5、下游引物的序列由5’端到3’端包括第二通用引物序列和根據靶標設計的特異性下游引物序列；
6、其中，所述第一通用引物序列和第二通用引物序列選自測序平臺接頭序列的部分或全部。
7、在其中一個實施例中，所述第二通用引物序列含有barcode序列，用于區分不同樣品。
8、在其中一個實施例中，所述barcode序列的長度為6bp～12bp。
9、在其中一個實施例中，所述測序平臺包括華大測序平臺或illumina測序平臺。
10、在其中一個實施例中，所述第一通用引物序列包括gaacgacatggctacgatccgactt，所述第二通用引物序列包括tgtgagccaaggagttg-barcode序列-ttgtcttcctaagaccgcttggcctccgactt。
11、在其中一個實施例中，所述第一通用引物序列包括aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct，所述第二通用引物序列包括caagcagaagacggcatacgagat-barcode序列-gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatc。
12、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列和所述特異性下游引物序列的3’端最后1個堿基所對應靶標的位置不能是snp位點。
13、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列和所述特異性下游引物序列的3’端最后4個堿基所對應靶標的位置不能是snp位點。
14、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列和所述特異性下游引物序列的長度分別為18bp～38bp。
15、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列和所述特異性下游引物序列所擴增得到的擴增子的長度為100bp～600bp。
16、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列或所述特異性下游引物序列的gc含量為20％～80％。
17、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列與所述特異性下游引物序列的gc含量相差0％～30％。
18、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列或所述特異性下游引物序列的tm值為55℃～80℃。
19、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列和所述特異性下游引物序列的tm值為67℃～80℃。
20、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列和所述特異性下游引物序列的tm值為67℃～72℃。
21、在其中一個實施例中，所述特異性上游引物序列與所述特異性下游引物序列的tm值相差不超過5℃，可選地，不超過2℃，可選地，不超過1℃。
22、在其中一個實施例中，所述嵌合體為snvs或indels嵌合體的條件下，變異位置與所述特異性上游引物序列或所述特異性下游引物序列的5’端第一個堿基的距離為50bp～300bp。
23、在其中一個實本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.嵌合體文庫構建的引物組合，其特征在于，所述引物組合中，
2.根據權利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述第二通用引物序列含有barcode序列，用于區分不同樣品；
3.根據權利要求1或2所述的引物組合，其特征在于，所述測序平臺包括華大測序平臺或illumina測序平臺；
4.根據權利要求1或2所述的引物組合，其特征在于，所述特異性上游引物序列和所述特異性下游引物序列的3’端最后1個堿基所對應靶標的位置不能是SNP位點；
5.根據權利要求4所述的引物組合，其特征在于，所述嵌合體為SNVs或Indels嵌合體的條件下，變異位置與所述特異性上游引物序列或所述特異性下游引物序列的5’端第一個堿基的距離為50bp~300bp。
6.嵌合體文庫構建的方法，其特征在于，所述方法包括采用權利要求1至5中任一項所述的引物組合進行PCR擴增的步驟。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，采用一步法PCR擴增進行文庫構建。
8.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，PCR擴增的程序包括94℃~95℃?預變
9.根據權利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的體系包括緩沖液、dNTPs、DNA聚合酶、所述上游引物和所述下游引物中的一種或多種。
10.嵌合體檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1至5中所述的引物組合；
11.權利要求1至5中任一項所述的引物組合在制備嵌合體檢測的產品中的應用；
12.嵌合體檢測方法，其特征在于，所述方法包括采用權利要求6至9中任一項所述的嵌合體文庫構建的方法構建文庫；
...【技術特征摘要】
1.嵌合體文庫構建的引物組合，其特征在于，所述引物組合中，
2.根據權利要求1所述的引物組合，其特征在于，所述第二通用引物序列含有barcode序列，用于區分不同樣品；
3.根據權利要求1或2所述的引物組合，其特征在于，所述測序平臺包括華大測序平臺或illumina測序平臺；
4.根據權利要求1或2所述的引物組合，其特征在于，所述特異性上游引物序列和所述特異性下游引物序列的3’端最后1個堿基所對應靶標的位置不能是snp位點；
5.根據權利要求4所述的引物組合，其特征在于，所述嵌合體為snvs或indels嵌合體的條件下，變異位置與所述特異性上游引物序列或所述特異性下游引物序列的5’端第一個堿基的距離為50bp~300bp。
6.嵌合體文庫構建的方法，其特征在于，所述方法包括采用權利要求1至5中任一項所述的引物組合進行pcr擴增...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張向東，趙亞涵，汪利，江圣楠，胡琴，楊祖，
申請(專利權)人：蘇州貝康醫學檢驗實驗室有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。