【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物醫(yī)藥，具體本專利技術(shù)涉及一種廣譜抑制流感病毒的多肽及其在預(yù)防和/或治療流感病毒感染中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸系統(tǒng)傳染病，傳播速度快，遺傳變異性強(qiáng)。流感的防治是當(dāng)前醫(yī)學(xué)及藥學(xué)領(lǐng)域的重要研究課題。治療流感的藥物研究和專利技術(shù)具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。
2、流感是人、禽、畜共患病，抗流感藥物的研發(fā)是我國藥物研發(fā)的重點(diǎn)。
3、流感病毒屬于正粘病毒科，根據(jù)內(nèi)部蛋白抗原性的不同，分為甲(a)、乙(b)、丙(c)三型，三種類型沒有共同的抗原。甲型流感病毒是感染人、禽和其他動物的主要流感病毒亞型，其基因組為8條節(jié)段式單鏈負(fù)鏈rna，其中包膜蛋白包括血凝素(hemagglutinin,ha)、神經(jīng)氨酸酶(neuraminidase,na)和m2離子通道蛋白。根據(jù)表面結(jié)構(gòu)蛋白ha和na的抗原性不同，又將甲型流感病毒分為不同血清亞型，ha包括h1～h18共18種亞型，na包括ni～n10共10種亞型，故理論上共有180種亞型組合。禽類是流感病毒的天然宿主，不是所有亞型都能感染人類，目前發(fā)現(xiàn)h1n1、h2n2和h3n2亞型以人類為宿主，但高致病的h5n1、h7n7、h9n2、h7n2和h7n3等亞型也已出現(xiàn)感染人的病例。高致病流感病毒是主要由野生禽類傳播的惡性流感，在人際間進(jìn)行傳播并造成新一輪的世界大流行的可能性使得世界各國對高致病流感病毒實(shí)時(shí)嚴(yán)格監(jiān)控。
4、流感病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞是其感染機(jī)體的第一步。流感病毒通過其包膜表面的血凝素蛋白(hemagglutinin,h
5、在流感的預(yù)防方面，季節(jié)性流感的預(yù)防主要依靠疫苗接種，但由于流感病毒表面抗原血清學(xué)亞型眾多，常常使得流感病毒疫苗株和流行株的抗原性不匹配，無法提供有效保護(hù)；流感病毒具有變異性強(qiáng)的特點(diǎn)，疫苗研發(fā)制備速度落后于病毒變異速度，新型株系病毒出現(xiàn)后，對應(yīng)疫苗的制備至少需要6個月的時(shí)間，使得對于流感的預(yù)防處于被動狀態(tài)。而且，流感疫苗的保護(hù)期僅有半年到一年，需要每年接種注射，給人們的生活造成不便。
6、高致病流感不同于季節(jié)性流感，由于病毒惡性程度過強(qiáng)，目前沒有可用的人用疫苗，并且為避免宿主選擇性壓力導(dǎo)致的快速病毒抗原變異，多數(shù)國家采取禁止或不提倡使用該疫苗的政策。
7、日前臨床應(yīng)用的抗流感藥物，按作用機(jī)理主要分為三類：m2離子通道阻滯劑，神經(jīng)氨酸酶(na)抑制劑和rna酶抑制劑。m2離子通道阻滯劑，以金剛烷胺和金剛乙胺為代表；另一類是抑制流感病毒釋出的神經(jīng)氨酸酶抑制劑，奧司他韋和扎納米韋；還有一類rna酶抑制劑，如法匹拉韋主要用于治療流感病毒耐藥株的感染。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，目前所有已上市的抗流感藥物均出現(xiàn)了耐藥病毒株，由于耐藥性過于嚴(yán)重，美國疾病控制與預(yù)防中心已建議金剛烷胺、金剛乙胺類藥物不作為臨床治療使用。目前耐藥程度最輕的扎納米韋應(yīng)用流感病毒敏感株mdck細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示：扎納米韋對h5n1、h6n1、h9n2三種亞型病毒的半數(shù)抑制濃度(ic50)為8.5-14.0μm。
8、利用生物技術(shù)研發(fā)的抗流感藥物，例如寡核苷酸、唾液酸酶融合蛋白(das181)、多肽(成纖維細(xì)胞生長因子4的信號序列衍生肽eb)等，在實(shí)驗(yàn)室研究中顯示了不同程度的抗流感活性，但目前還沒有商品化的藥物問世。上述表明，目前已上市的抗流感病毒藥物數(shù)量少，且都出現(xiàn)了耐藥株，對于致死率高的流感病毒，如高致病h5n1流感病毒，尚未有特效疫苗和藥物。
9、多肽是以氨基酸為基本單位組成的分子，其主要特點(diǎn)是選擇性高、作用濃度低。與抗體或其他治療性蛋白相比，多肽有相似的作用模式，但多肽的免疫原性更低。與小分子藥物相比，多肽的分子量較大，可以更有效地抑制蛋白與蛋白相互作用，選擇性和特異性更高，作用濃度及副作用更低。當(dāng)前，小分子藥物研發(fā)日趨困難，新興的抗體等大分子藥物研發(fā)周期長，需要重新審視并重視多肽藥物。
10、流感病毒的血凝素ha以三聚體的形式存在于病毒包膜上，即ha纖突由三個ha單體分子組成，每個單體ha分子由ha1和ha2兩個亞基組成，球狀頭部由ha1組成，含有受體結(jié)合位點(diǎn)和抗原決定簇，桿狀柄部由ha2和部分ha1組成，與病毒包膜相連。ha1亞基與ha2亞基之間依靠二硫鍵連接，以高致病h5n1株系例，ha1亞基長度為345個氨基酸殘基，ha2亞基長度為225個氨基酸殘基，不同流感病毒ha蛋白長度略有差異。雖然流感病毒株系眾多，但ha2部分都是高度保守的。在功能上，hai亞基負(fù)責(zé)與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體識別并結(jié)合，使病毒駐留并吸附在宿主細(xì)胞表面，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞的內(nèi)吞作用。當(dāng)整個病毒顆粒被內(nèi)吞入細(xì)胞的內(nèi)含體中之后，在內(nèi)含體的酸性環(huán)境中，ha2亞基發(fā)生變構(gòu)，其疏水性融合肽釋放并插入到細(xì)胞的內(nèi)含體膜中，將內(nèi)含體膜與病毒包膜拉近，并最終完成細(xì)胞內(nèi)含體膜與病毒包膜的融合，使得病毒基因組釋放到細(xì)胞漿中，完成病毒對宿主細(xì)胞的侵入。相對保守的ha2亞基的膜融合功能是通過高度保守區(qū)—七肽重復(fù)區(qū)(heptad?repeat,hr)完成的，該區(qū)域是抗病毒藥物研發(fā)的熱門靶標(biāo)。hr區(qū)在包膜病毒中普遍存在，如正粘病毒(如流感病毒等)、冠狀病毒(如sars病毒等)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(如hiv病毒等)中都有hr域，且高度保守，均含有兩段稱為七肽重復(fù)(hr)序列，n端的七肽重復(fù)序列稱謂hr1，c端的七肽重復(fù)序列稱謂hr2，在膜融合過程中，hr2以反向平行方式附著到hr1形成的溝槽中，形成穩(wěn)定的發(fā)卡結(jié)構(gòu)。對于高度保守的hr區(qū)，有很多包膜病毒藥物的研究報(bào)道，對hiv-1，sars冠狀病毒(sars-cov)，人呼吸道合胞病毒(hrsv)等病毒的研究表明，外源加入hr1或hr2多肽能抑制病毒感染，其作用機(jī)理為：外源多肽能阻礙病毒融合蛋白上的hr2與hr1之間的相互作用，進(jìn)而阻斷病毒膜融合蛋白的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換，阻斷病毒包膜和細(xì)胞膜間的融合。其中，源于hiv-1融合蛋白gp41的hr2區(qū)的多肽恩夫韋地(t-20)，作為第一個hiv-1進(jìn)入抑制劑，已于2003年上市。中國專利(專利技術(shù)名稱：抑制流感病毒感染的方法及其藥物，授權(quán)公告號cn101186637b，申請日2007.12.18)中，專利技術(shù)主體也為來源于流感病毒的hr1和hr2區(qū)域的多肽。該專利涉及的hr1和hr2區(qū)域的多肽通過阻本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：廣譜抑制流感病毒的多肽包括下述選擇：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：所述修飾指在所述氨基酸序列上進(jìn)行常規(guī)修飾；或，連接有用于多肽或蛋白質(zhì)檢測或純化的標(biāo)簽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：所述常規(guī)修飾包括乙酰化、酰胺化、環(huán)化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、熒光基團(tuán)修飾、聚乙二醇PEG修飾、固定化修飾；所述的標(biāo)簽包括His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc、ProfinityeXact。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：所述廣譜抑制流感病毒的多肽為SEQ?ID?NO:1、SEQ?ID?NO:3-26所示的任意一個氨基酸所示序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：所述多肽為上述任意一種所述多核苷酸序列，多核苷酸序列選自下列多核苷酸序列之一：
6.一種克隆或表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求1-5任意一項(xiàng)所述多肽的多核苷酸。
7
8.一種藥物組合物，其特征在于，以單獨(dú)或聯(lián)合的方式包含治療有效量的權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多肽或其衍生物、多核苷酸、和/或權(quán)利要求6所述的載體、和/或權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞作為有效成分。
9.一種權(quán)利要求1-8任意一項(xiàng)任的應(yīng)用，其特征在于：所述多肽和/或其衍生物、和/或多核苷酸、和/或載體、和/或宿主細(xì)胞在制備預(yù)防和/或治療流感病毒感染的藥物中的應(yīng)用。
10.一種用于治療流感病毒感染的試劑盒，其特征在于：包括權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的多肽或其衍生物、多核苷酸、和/或權(quán)利要求6所述的載體、和/或權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞、和/或權(quán)利要求8所述的藥物組合物。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：廣譜抑制流感病毒的多肽包括下述選擇：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：所述修飾指在所述氨基酸序列上進(jìn)行常規(guī)修飾；或，連接有用于多肽或蛋白質(zhì)檢測或純化的標(biāo)簽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：所述常規(guī)修飾包括乙酰化、酰胺化、環(huán)化、糖基化、磷酸化、烷基化、生物素化、熒光基團(tuán)修飾、聚乙二醇peg修飾、固定化修飾；所述的標(biāo)簽包括his6、gst、egfp、mbp、nus、ha、igg、flag、c-myc、profinityexact。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：所述廣譜抑制流感病毒的多肽為seq?id?no:1、seq?id?no:3-26所示的任意一個氨基酸所示序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的廣譜抑制流感病毒的多肽，其特征在于：所述多...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陸路，郭德銀，黃鑫，徐巍，姜世勃，蒲靜，王茜，
申請(專利權(quán))人：復(fù)旦大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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