【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種新7β-羥基類固醇脫氫酶基因及其在制備熊去氧膽酸中的應用，屬于基因工程與生物催化領域。
技術介紹
1、熊去氧膽酸(udca)作為美國食品和藥物管理局(fda)批準的用于治療原發性膽汁性肝硬化的唯一藥物，具有溶解膽結石，治療膽汁淤積、膽源性胰腺炎、原發性膽管炎、原發性膽汁性肝硬化、藥物性肝炎和改善肝移植效果的作用。最新研究發現，熊去氧膽酸還介導并影響癌癥基因組中致癌信號通路調控，用于癌癥治療。在治療進行性神經系統疾病時，熊去氧膽酸能夠改善受損線粒體功能，發揮神經保護作用。
2、目前，熊去氧膽酸的制備方法主要包括是化學合成法和生物轉化法。其中通過化學合成的熊去氧膽酸僅占總合成路線的30％，還遠不能滿足市場對熊去氧膽酸的用量及質量的需求。另外化學合成熊去氧膽酸過程復雜，且涉及有毒物質的使用和高溫高壓條件，在生產安全和環境保護方面具有危害，所以新的研究集中在以鵝去氧膽酸(cdca)為前體，以微生物轉化或生物酶催化的方式獲得熊去氧膽酸。
3、微生物全細胞催化法和酶催化法綠色環保，順應當今社會發展和保護環境的大趨勢，是今后的研究熱點。酶催化法主要利用不同來源的7α-hsdh和7β-hsdh這兩種酶通過兩步酶促反應將鵝去氧膽酸轉化為熊去氧膽酸，然而兩步酶促反應需要添加昂貴的輔因子nad(p)+，增加了合成的成本。而近年來，利用常見的微生物全細胞催化法合成化學產品已經取得了不錯的進展，因為它不僅轉化效率高、特異性好，還可以利用微生物自身的輔酶再生系統，而且避免了純化蛋白的步驟，對于研究全細胞催化合熊去氧
技術實現思路
1、本專利技術提供一個新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，可與7α-羥基類固醇脫氫酶基因利用大腸桿菌和畢赤酵母作為底盤細胞進行異源表達，從而得到不同轉化熊去氧膽酸的重組菌株。
2、為了解決7β-羥基類固醇脫氫酶的低催化活性、低轉化率和催化工藝不成熟的問題，本專利技術通過比對檢索ncbi數據庫，篩選出了一種源自無害梭菌(clostridiuminnocuum)的7β-羥基類固醇脫氫酶，在參與熊去氧膽酸的催化生產工藝方面有著更好的催化潛力，為全細胞催化生產熊去氧膽酸的工藝提供了一種新的選擇方向，同時選擇不同的底盤細胞作為高效生產熊去氧膽酸的平臺。
3、本專利技術提供了一種催化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組表達質粒，所述重組表達載體以大腸桿菌的petduet-1雙啟動子質粒以及畢赤酵母的ppic3.5k和ppiczx為基礎載體，連接有e7α-hsdh和cin7β-hsdh兩個脫氫酶基因。
4、本專利技術提供了上述技術方案所述重組表達質粒的構建方法，包括以下步驟：
5、pcr分別擴增e7αhsdh和cin7β-hsdh基因，將雙啟動子載體進行酶切，分別取2μl酶切產物、2μl?pcr產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證其條帶大小。pcr產物經消化、純化后，目的片段與骨架進行同源重組，重組體系化轉大腸桿菌jm109感受態，挑取轉化子提取質粒，測序驗證正確，即得到重組質粒。其它重組質粒均由以上述方法進行構建。
6、本專利技術還提供了一種催化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組工程菌株，所述重組工程菌株通過重組表達質粒分別通過化轉入大腸桿菌及電轉整合畢赤酵母而得到。
7、本專利技術還提供了一種全細胞催化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的方法，包括以下步驟：
8、將所述重組大腸桿菌接種到tb液體培養基進行發酵培養，當菌體濃度od600達到0.8時，添加2mm的iptg進行誘導，誘導溫度為25℃，繼續發酵18h，之后投入6g/l鵝去氧膽酸作為底物繼續發酵轉化得到熊去氧膽酸。
9、將所述重組畢赤酵母接種到ypg液體培養基進行發酵培養，將適量菌液轉接于bmgy繼續培養，使得菌液密度值達到7-8時進行收集菌體，棄上清、取沉淀。將其菌泥轉移至bmmy培養基中，將發酵培養液與底物鵝去氧膽酸和誘導劑甲醇混合；鵝去氧膽酸的投加量為6g/l，甲醇投加的體積百分含量為3.3％；所述發酵轉化培養的條件為28～30℃進行發酵轉化培養，得到熊去氧膽酸。
10、最后利用乙酸乙酯從發酵液中萃取發酵產物，通過tlc和hplc分析發酵產物的轉化情況。
11、利用本專利技術篩選獲得的新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因及全細胞催化法在重組大腸桿菌和畢赤酵母中高效表達后可生產熊去氧膽酸。在投料量6g/l的情況下，重組大腸桿菌反應催化24h，轉化率為87.6％，畢赤酵母轉化率可以高達97.8％。
12、通過對數據庫的挖掘與分析，本專利技術提供了一種新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因及其應用，可促進其在醫藥等領域中的應用；此外，本專利技術發酵使用的培養基簡單，無需添加昂貴的輔因子，經濟成本低，對今后的工業應用具有非常大的借鑒意義。
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1.一種新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于，所述7β-羥基類固醇脫氫酶基因核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，構建了能夠高效制備熊去氧膽酸的重組菌。
2.根據權利要求1所述新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于：同時表達7α-羥基類固醇脫氫酶和7β-羥基類固醇脫氫酶，并構建了高效轉化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組大腸桿菌BL21(DE3)和重組畢赤酵母GS115。
3.根據權利要求2所述的新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于，高效轉化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組大腸桿菌BL21包括下列步驟：
4.根據權利要求2所述的新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于，高效轉化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組畢赤酵母GS115包括下列步驟：
5.一種新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因的應用，其特征在于，將該新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因在制備熊去氧膽酸中的應用，包括下列步驟：
6.如權利要求5所述的應用得到的熊去氧膽酸。
【技術特征摘要】
1.一種新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于，所述7β-羥基類固醇脫氫酶基因核苷酸序列如seq?id?no.1所示，構建了能夠高效制備熊去氧膽酸的重組菌。
2.根據權利要求1所述新型7β-羥基類固醇脫氫酶基因，其特征在于：同時表達7α-羥基類固醇脫氫酶和7β-羥基類固醇脫氫酶，并構建了高效轉化鵝去氧膽酸合成熊去氧膽酸的重組大腸桿菌bl21(de3)和重組畢赤酵母gs115。
3.根據權利要求2所述的新型7β-羥基類固...
【專利技術屬性】
技術研發人員：何希宏，楊梅，劉曉光，陳天紅，管位山，趙化冰，金鵬，王碩，
申請(專利權)人：天津科技大學，
類型：發明
國別省市：
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