【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及一種crispr/cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，屬于生物分析化學(xué)與傳感。
技術(shù)介紹
1、凝血酶是一種能將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的多功能絲氨酸蛋白酶，在凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中起重要作用。它是凝血障礙和多種病理過程重要標(biāo)志物。凝血酶在生理過程中的作用取決于其濃度。在正常凝血過程中，血液中凝血酶的濃度通常范圍在納摩爾（nm）到低微摩爾（μm）水平。然而，在患有凝血障礙的患者中，這一濃度可能低至皮摩爾（pm）水平。其濃度的失衡可能導(dǎo)致多種疾病，包括血栓、阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化和肝病等。因此，開發(fā)出高靈敏度、高選擇性的凝血酶檢測(cè)方法至關(guān)重要。傳統(tǒng)的免疫分析方法，如酶活性法和酶聯(lián)免疫吸附法，存在抗原和樣本量大、反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、成本高等局限性。
2、核酸適配體是一種有效的功能核酸探針，能夠高特異性地識(shí)別凝血酶等目標(biāo)分子。它們具備體積小、易于修飾、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，常用于生物傳感器中。apt15和apt29是常用的適配體，可與凝血酶的不同位點(diǎn)結(jié)合。近年來，基于適配體的三明治型測(cè)定法（如sers、熒光、比色等）已廣泛應(yīng)用于凝血酶檢測(cè)，但這些方法通常面臨檢測(cè)限差、測(cè)量時(shí)間長(zhǎng)、樣品制備復(fù)雜等問題。
3、crispr/cas系統(tǒng)是一種細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，能特異性切割靶標(biāo)核酸。特別是lbcas12a在與靶dna結(jié)合后表現(xiàn)出的“反式切割”活性，使其成為信號(hào)放大中一種強(qiáng)大的工具。例如zhu等人將apt29適配體鏈接了一段cas12a的激活dna序列（apt29-acdna），apt15適配體被修飾在基板
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題是，克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種crispr/cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，通過將crispr/cas12a激活dna（acdna）和凝血酶適配體apt15共同修飾于金納米粒子表面，一個(gè)金顆粒表面可以修飾上百個(gè)acdna，實(shí)現(xiàn)了凝血酶的一級(jí)信號(hào)放大，之后acdna激活crispr/cas12a體系中cas12a的酶活性，切割fq-dna，使其熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，熒光信號(hào)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)二級(jí)信號(hào)放大。
2、本專利技術(shù)提供一種crispr/cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)信號(hào)放大適配體傳感器用于凝血酶靈敏檢測(cè)的方法，包括以下步驟：
3、步驟1、球形核酸探針的制備，將適配體apt15與acdna共同修飾于金納米粒子（aunps）上，制備球形核酸探針aunps-apt15/acdna；
4、步驟2、功能化磁性微粒的制備，將適配體apt29修飾到磁性微粒上，制備獲得磁性微粒-apt29；
5、步驟3、凝血酶檢測(cè)，將修飾了核酸適配體apt29的磁性微粒與不同濃度凝血酶混合孵育，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白凝血酶的捕捉，之后加入aunps-apt15/acdna球形核酸探針并進(jìn)行孵育，形成磁性微粒/凝血酶/金納米顆粒的三明治夾心結(jié)構(gòu)；
6、步驟4、配制cripsr/cas12a體系，將特定acdna對(duì)應(yīng)的crrna、cas12a蛋白于緩沖溶液中混合，配制成cripsr/cas12a體系；
7、步驟5、凝血酶信號(hào)輸出與二級(jí)信號(hào)放大，向步驟3的檢測(cè)溶液中加入步驟4的cripsr/cas12a體系以及熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)雙標(biāo)記的報(bào)告探針fq-ssdna，進(jìn)行靶標(biāo)識(shí)別以及信號(hào)轉(zhuǎn)化；
8、步驟6、采集步驟5溶液的熒光信號(hào)，建立熒光發(fā)光強(qiáng)度與凝血酶濃度之間的線性關(guān)系。
9、本專利技術(shù)提供一種利用crispr/cas12a實(shí)現(xiàn)信號(hào)級(jí)聯(lián)放大的凝血酶檢測(cè)方法，將crispr/cas12a激活dna（acdna）和凝血酶適配體apt15共同修飾于金納米粒子表面，同時(shí)將凝血酶適配體apt29修飾于磁性微粒表面。凝血酶存在時(shí)，金顆粒和磁性微粒由于適配體的識(shí)別作用會(huì)形成三明治結(jié)構(gòu)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)一個(gè)金顆粒表面可以修飾上百個(gè)acdna，從而實(shí)現(xiàn)了一級(jí)信號(hào)放大；在后續(xù)加入crispr/cas12a體系后，這些acdna會(huì)激活cas12a的酶活性，進(jìn)而可以對(duì)fq-dna進(jìn)行切割，使得f和q基團(tuán)分離，致使熒光信號(hào)增強(qiáng)，從而實(shí)現(xiàn)二級(jí)信號(hào)的放大。同時(shí)，本專利技術(shù)使用磁性微粒作為支撐材料，由于反應(yīng)發(fā)生在溶液中，克服了適配體和凝血酶在固體底物上引起的擴(kuò)散限制動(dòng)力學(xué)而導(dǎo)致的反應(yīng)緩慢的問題。
10、作為本專利技術(shù)進(jìn)一步優(yōu)化的技術(shù)方案如下：
11、所述步驟1中，金納米粒子aunps的粒徑為13nm，由檸檬酸修飾，其制備方法參考文獻(xiàn)【liu?j,?lu?y.?nature?protocols,?2006,?1(1):?246-252.】；準(zhǔn)備acdna和apt15兩條dna鏈，固定aunps和修飾dna的總量（acdna+apt15）為1:500不變，改變acdna和apt15的相對(duì)量，參照文獻(xiàn)【hao?y,?li?y,?song?l,?et?al.?jacs,?2021,?143(8):?3065-3069.】制備基于aunps的覆蓋有不同acdna和apt15量的球形核酸，具體地球形核酸探針中apt15與acdna的摩爾比為1:0.5～1:3。
12、所述步驟2中，洗滌磁性微粒，將磁性微粒重懸，之后磁分離2min，移去上清，用100ul?25mm?mes(ph=5)清洗磁性微粒，并在充分混合的情況下培養(yǎng)10min，重復(fù)3次；
13、加入適配體apt29于洗滌過的磁性微粒，混合均勻，在室溫下孵育30?min；加入30ul?100?mg/ml?edc，混合均勻；加入10?ul的25?mm?（ph=5）?mes溶液，最終體積為100?ul，在室溫下培養(yǎng)5h；通過羧基-氨基相互作用將apt29凝血酶適配體固定在磁性微粒表面。磁分離，去上清，重懸于100?ul?pbst(含0.05%吐溫20)緩沖液中，加入5?ul?superblock?(pbs)緩沖液進(jìn)行封閉處理30?min；用100?ul?pbst緩沖液洗滌4次，最后重懸于400?ul?pbst緩沖液中，于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>
14、所述步驟2中，每毫克磁性微粒上修飾0.07?pm～700?pm?apt29。
15、所述步驟3中，向修飾核酸適配體apt29的磁性微粒中加入不同濃度的目標(biāo)蛋白凝血酶進(jìn)行孵育，磁分離、除上清，再將獲得的沉淀與步驟1中制備的具有不同apt15與acdna摩爾比的球形核酸探針進(jìn)行孵育，形成磁性微粒/凝血酶/aunps-apt15/acdna三明治夾心結(jié)構(gòu)。
16、所述步驟4中，配制c本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟1中，金納米粒子AuNPs的粒徑為13nm，由檸檬酸修飾；球形核酸探針中Apt15與acDNA的摩爾比為1:0.5～1:3。
3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2中，洗滌磁性微粒，將磁性微粒重懸，之后磁分離2min，移去上清，用100ul25mM?MES清洗磁性微粒，并在充分混合的情況下培養(yǎng)10min，重復(fù)3次；
4.?根據(jù)權(quán)利要求3所述CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2中，每毫克磁性微粒上修飾0.07?pM～700?pM?Apt29。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3中，向修飾核酸適配體Apt29的磁性微粒中加入不同濃度的目標(biāo)蛋白凝血酶進(jìn)行孵育，磁分
6.?根據(jù)權(quán)利要求5所述CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟4中，配制CRIPSR/Cas12a體系，Cas12a蛋白購買于蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司，緩沖溶液為10×NEB?Buffer??r2.1，購自New?England?BioLabs（美國）；crRNA與Cas12a蛋白的摩爾比15:10。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟5中，向形成磁性顆粒/凝血酶/AuNPs-Apt15/acDNA三明治夾心結(jié)構(gòu)的溶液中加入CRIPSR/Cas12a體系以及熒光基團(tuán)F和淬滅基團(tuán)Q雙標(biāo)記的DNA進(jìn)行切割，孵育60min，進(jìn)行靶標(biāo)識(shí)別以及信號(hào)輸出。
8.?根據(jù)權(quán)利要求7所述CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟6中，通過熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度變化實(shí)現(xiàn)凝血酶的檢測(cè)，所用熒光分光光度計(jì)型號(hào)為FL-?8500購于美國的PerkinElmer。
9.?根據(jù)權(quán)利要求1所述CRISPR/Cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述acDNA的序列為SH-AAT?ATG?TCA?TTA?TGT?GCT?GCC?ATA?TCT?ACT?TCA?GAA?ACT。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種crispr/cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述crispr/cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟1中，金納米粒子aunps的粒徑為13nm，由檸檬酸修飾；球形核酸探針中apt15與acdna的摩爾比為1:0.5～1:3。
3.?根據(jù)權(quán)利要求2所述crispr/cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2中，洗滌磁性微粒，將磁性微粒重懸，之后磁分離2min，移去上清，用100ul25mm?mes清洗磁性微粒，并在充分混合的情況下培養(yǎng)10min，重復(fù)3次；
4.?根據(jù)權(quán)利要求3所述crispr/cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟2中，每毫克磁性微粒上修飾0.07?pm～700?pm?apt29。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述crispr/cas12a介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)凝血酶信號(hào)放大檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟3中，向修飾核酸適配體apt29的磁性微粒中加入不同濃度的目標(biāo)蛋白凝血酶進(jìn)行孵育，磁分離、除上清，再將獲得的沉淀與步驟1中制備的具有不同apt15與acdna摩爾比的球形核酸探針進(jìn)行孵育，形成磁性微粒/凝血酶/aunps-apt15/acdna三明治夾心結(jié)構(gòu)。
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：蓋宏偉，王亞芳，宗成華，卜令斌，張瑞，劉秀財(cái)，祝田，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：江蘇師范大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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