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    一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法技術

    技術編號:43743190 閱讀:15 留言:0更新日期:2024-12-20 13:03
    本發明專利技術公開了一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,涉及分子生物學技術領域,所述高通量SSR分子標記鑒定李雜交后代的方法包括:制備SSR引物體系、運行SSR?PCR擴增程序、進行瓊脂糖凝膠電泳和進行毛細管電泳,所述SSR引物體系包括:去離子水、dNTP、Buffer、F、R0、DNA模板和Taq酶,所述DNA模板的制備方法為:將78個原始樣品放入裝有抗生素的培養基中培養,向培養基中加入氯霉素,使用生理鹽水懸浮并漂洗去殘留培養基,加入NaOH?SDS進行裂解,加入乙酸鉀恢復中性后,使用離心法分離雜質和DNA,對DNA進行提純,得到DNA模板。本發明專利技術通過設計有DNA模板,實現了在鑒定過程中快速提取DNA的功能,解決了鑒定過程中DNA提取時間長降低鑒定效率的問題,降低了DNA提取的難度。

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及分子生物學,具體為一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法。


    技術介紹

    1、分子鑒定技術指利用生物體dna或rna水平上的多態性進行鑒定、遺傳分析和基因定位,廣義上指可遺傳并可檢測的dna序列或蛋白質,狹義上指反應生物個體或種群間差異的特異性dna片段,基于個體間遺傳物質內核苷酸序列變異,是dna水平遺傳多態性的直接反饋,主要類型包括基于southem雜交的分子標記、以重復序列為基礎的分子標記以及以pcr為基礎的分子標記等,傳統的ssr分型方法如凝膠電泳和毛細管電泳等,通量低且依賴于電泳圖譜的相似程度進行比較,耗時費力且準確性有限,隨著高通量測序技術的發展,ssr分子標記技術也實現了高通量和高進準的分型,為遺傳學研究提供了更高效的工具,高通量ssr分子標記技術基于擴增子測序技術,實現了在單堿基水平上的分型,且能同時對多個品種的數千個ssr點位進行準確分型,降低了分型成本和耗時,提高了分型準確性,該技術避免了傳統分型方法中的電泳圖譜比較,實現了任意兩個品種間的直接比較,極大提高了工作效率,同時其豐富的多態性和高信息量,使得在遺傳育種和基因定位等領域具有顯著優勢;

    2、ssr引物的開發難度大,新的ssr引物的開發和合成需要較高的投入,技術難度大,現有ssr標記不足,目前可用的ssr標記數量有限,無法覆蓋所有的功能基因,一定程度上限制了ssr分子標記技術的應用范圍,ssr多態性檢測受限,ssr多態性的檢測核應用在很大程度上依賴于pcr擴增的效果,pcr擴增不理想會直接影響ssr標記的應用效果。

    3、1、專利文件cn104561332b公開了一種鑒定山楊性別的ssr分子標記及其應用,上述專利實現了鑒定的引物特異性極高,穩定性極強的ssr引物,不需要進行聚丙烯酰胺凝膠電泳片段分離,只需要進行常規的瓊脂糖凝膠電泳檢測即可完成對山楊性別的快速鑒定,為山楊的定向育種提供理論和技術上的指導,但上述專利不能實現在鑒定過程中快速提取dna的功能。

    4、2、專利文件cn111424108b公開了一種利用ssr分子標記鑒定冬青種質的方法,上述專利實現了多態性檢出率高、分辨率更好、穩定可靠、簡單高效,但上述專利不能實現對蛋白質雜質和rna進行去除的功能。

    5、3、專利文件cn108277295b公開了適用于毛細管電泳檢測技術的一組玉米ssr分子標記及其應用,上述專利實現了能夠在基因組水平上拓展了玉米可用標記位點的范圍;為玉米品種、種質資源鑒定,親緣關系評價,細胞質遺傳特性等研究提供新工具,應用前景良好,但上述專利不能實現對dna分子變性的功能。

    6、4、專利文件cn112029825b公開了花菜類ssr分子標記引物的篩選方法及應用,上述專利實現了構建了一種快速、準確的鑒定我國花椰菜和青花菜品種的方法,為今后花菜類產業化中種苗純度和真實性鑒定及種質資源管理提供理論依據,但上述專利不能實現保障檢測準確和降低成本及污染的功能。

    7、綜上所述,上述專利不能實現在鑒定過程中快速提取dna的功能,不能實現對蛋白質雜質和rna進行去除的功能,不能實現對dna分子變性的功能,不能實現保障檢測準確和降低成本及污染的功能,導致鑒定過程中dna提取時間長降低鑒定效率、樣品中dna雜質對檢測結果的影響、毛細管電泳過程中dna穩定和檢測效率低、在處理大量樣品時通量低、耗時長、準確性較低和廢棄物對環境造成污染的問題;

    8、為此,本申請提出了一種能實現在鑒定過程中快速提取dna的功能,能實現對蛋白質雜質和rna進行去除的功能,能實現對dna分子變性的功能,能實現保障檢測準確和降低成本及污染的功能的高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法。


    技術實現思路

    1、本專利技術的目的在于提供一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,以解決上述
    技術介紹
    中提出的不能實現在鑒定過程中快速提取dna的功能,不能實現對蛋白質雜質和rna進行去除的功能,不能實現對dna分子變性的功能,不能實現保障檢測準確和降低成本及污染的功能,導致鑒定過程中dna提取時間長降低鑒定效率、樣品中dna雜質對檢測結果的影響、毛細管電泳過程中dna穩定和檢測效率低、在處理大量樣品時通量低、耗時長、準確性較低和廢棄物對環境造成污染的技術問題。

    2、為實現上述目的,本專利技術提供如下技術方案:一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,所述高通量ssr分子標記鑒定李雜交后代的方法包括:制備ssr引物體系、運行ssr-pcr擴增程序、進行瓊脂糖凝膠電泳和進行毛細管電泳,所述ssr引物體系包括:去離子水、dntp、buffer、f、r0、dna模板和taq酶,所述dna模板的制備方法為:

    3、步驟1:將78個原始樣品放入裝有抗生素的培養基中培養;

    4、步驟2:向培養基中加入氯霉素;

    5、步驟3:使用生理鹽水懸浮并漂洗去殘留培養基;

    6、步驟4:加入naoh-sds進行裂解;

    7、步驟5:加入乙酸鉀恢復中性后,使用離心法分離雜質和dna;

    8、步驟6:對dna進行提純,得到dna模板。

    9、優選的,所述dna模板的制備方法還有:

    10、步驟1:準備1mol/l的nacl溶液、含辛醇的氯仿、0.15mol/l的nacl溶液、蛋白酶k、氯仿、無水乙醇、75%乙醇和去離子水;

    11、步驟2:將78個樣品在0.15mol/l的nacl溶液中破碎;

    12、步驟3:加入1mol/l的nacl溶液進行提取,得到dnp粘液;

    13、步驟4:加入含有辛醇的氯仿進行搖蕩乳化;

    14、步驟5:離心去除蛋白質,回收水相,用2倍體積的95%乙醇將dna鈉鹽沉淀出來;

    15、步驟6:使用75%乙醇對沉淀進行洗滌,在室溫中干燥處理;

    16、步驟7:加入去離子水溶解dna,得到dna模板。

    17、優選的,所述對dna進行提純的步驟為:

    18、步驟7:準備蛋白酶k、tris飽和酚、氯仿、異戊醇、無水乙醇、70%乙醇、te緩沖液和rna酶溶液;

    19、步驟8:向制備好的dna中加入蛋白酶k,置于搖床中消化;

    20、步驟9:加入等體積的tris飽和酚,搖勻后離心,分離出上層dna層,移入新離心管中;

    21、步驟10:在上清液中加入等體積的氯仿和異戊醇混合液,搖勻后離心,戲曲上層水相;

    22、步驟11:在上清液中加入等體積的無水乙醇,混勻后靜置;

    23、步驟12:分離出dna,使用70%乙醇洗滌2次,在真空環境中干燥;

    24、步驟13:將干燥后的dna溶于te緩沖液中,加入rna酶溶液進行處理,使用酚/氯仿抽提;

    25、步驟14:用70%乙醇洗滌2次,在真空環境中干燥處理,加入te緩沖液溶解dna,制得dna模板。<本文檔來自技高網...

    【技術保護點】

    1.一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述高通量SSR分子標記鑒定李雜交后代的方法包括:制備SSR引物體系、運行SSR-PCR擴增程序、進行瓊脂糖凝膠電泳和進行毛細管電泳,所述SSR引物體系包括:去離子水、dNTP、Buffer、F、R0、DNA模板和Taq酶,所述DNA模板的制備方法為:

    2.根據權利要求1所述的一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述DNA模板的制備方法還有:

    3.根據權利要求1所述的一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述對DNA進行提純的步驟為:

    4.根據權利要求1所述的一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述鑒定李雜交后代的方法為:

    5.根據權利要求1所述的一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述毛細管電泳檢測的方法為:

    6.根據權利要求1所述的一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述瓊脂糖凝膠電泳檢測為:

    7.根據權利要求1所述的一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述SSR引物體系共20μl,其中去離子水14.8μl、dNTP?0.4μl、Buffer?2μl、F?0.3μl、R0.3ul、DNA模板2μl和Taq酶0.2μl。

    8.根據權利要求5所述的一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述甲酰胺通過抑制DNA分子二級結構的形成,使DNA在電泳過程中保持單鏈狀態,甲酰胺通過降低核酸分子間的相互作用,減少DNA和RNA在電泳過程中的構象變化。

    9.根據權利要求1所述的一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述SSR-PCR擴增程序為:94℃預變性5min,94℃變形30s,60℃復性45s,72℃延伸50s,為一個循環,共35個循環,最終在72℃延伸5min。

    10.根據權利要求6所述的一種高通量SSR分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述瓊脂糖凝膠的濃度為2.0%。

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    【技術特征摘要】

    1.一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述高通量ssr分子標記鑒定李雜交后代的方法包括:制備ssr引物體系、運行ssr-pcr擴增程序、進行瓊脂糖凝膠電泳和進行毛細管電泳,所述ssr引物體系包括:去離子水、dntp、buffer、f、r0、dna模板和taq酶,所述dna模板的制備方法為:

    2.根據權利要求1所述的一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述dna模板的制備方法還有:

    3.根據權利要求1所述的一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述對dna進行提純的步驟為:

    4.根據權利要求1所述的一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述鑒定李雜交后代的方法為:

    5.根據權利要求1所述的一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述毛細管電泳檢測的方法為:

    6.根據權利要求1所述的一種高通量ssr分子標記技術鑒定李雜交后代的方法,其特征在于:所述...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:方波武崢趙倩陳元平楊麗李雪
    申請(專利權)人:重慶市農業科學院
    類型:發明
    國別省市:

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