【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在制備預防、治療prrsv感染的藥物中的應用。
技術介紹
1、豬繁殖與呼吸綜合征（porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome，prrs）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine?reproductive?and?respiratory?syndromevirus，prrsv）引起的一種以妊娠母豬呼吸困難、流產、產死胎、弱胎或木乃伊胎和仔豬生長緩慢為特征的一種高度接觸性傳染性疾病。由于病豬耳朵發紺發紫，此病也稱為“豬藍耳病”。prrsv有著變異快、防控難的特點，與豬流感病毒感染不同，prrsv能夠調節機體的天然免疫反應從而引起免疫抑制，疫苗的防控效果并不理想。prrs臨床癥狀以母豬呼吸困難和繁殖障礙、仔豬生長緩慢為主，對新生仔豬和母豬具有極高致死率，嚴重危害著養豬業的健康發展。prrsv存在變異快、防控難的特點，滅活疫苗的免疫保護較弱，而弱毒苗又存在毒力返祖的現象，導致prrsv疫苗的整體保護效果并不理想。因此實現對prrsv的有效防控目前仍是亟待解決的一個難題。
2、干擾素（interferon,?ifn）是細胞在病毒或其他刺激因子的作用下產生的一大類具有抗病毒活性的蛋白質，具有廣譜的抗病毒作用和免疫調節作用，在天然免疫應答中發揮著重要功能。ifn根據其編碼基因序列及受體類型不同可分為三大家族：ifn-ⅰ、ifn-ⅱ、ifn-ⅲ。ifn-ⅲ（ifn-λ）是近些年最新發現的一種干擾素亞型，其抗病毒功
3、目前，ifn的生產除了從豬白細胞中分離外，主要依靠基因工程方法進行表達純化。將ifn的目的基因插入宿主基因，誘導宿主基因表達ifn，并通過一定的方法進行純化，從而獲取ifn。常用的ifn表達系統有大腸桿菌表達系統、酵母表達系統、桿狀病毒表達系統、腺病毒表達系統等，桿狀病毒和酵母表達系統生產出來的蛋白活性優于大腸桿菌表達系統，能夠正確折疊并發揮生物學活性，但是蛋白表達量低、生產周期及生產成本高，難以大規模生產應用。而大腸桿菌表達系統生產成本低、生產周期短、蛋白表達量高，因此利用大腸桿菌表達系統進行ifn的表達更加適合生產實踐中的應用。但是，大腸桿菌表達系統產生的蛋白多為包涵體表達，難以正確折疊并復性成功，例如連丹花（“ⅲ型干擾素ifn-λ的表達純化及活性鑒定”[d]）構建了bl21/pet26b（+）/?ifn-λ3原核表達菌株，并通過1?μg/ml的iptg誘導劑成功誘導出可溶性ifn-λ3重組蛋白，但是重組蛋白在胞周質內總體表達量偏低。
4、因而，如何實現ifn-λ3的大規模生產是ifn-ⅲ制劑開發中面臨的重大技術問題。
技術實現思路
1、為解決現有技術中缺乏對prrsv感染有效的防控和治療手段的問題以及ifn-λ3難以大規模生產的問題，本專利技術旨在提供一種isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，并將其用于制備預防、治療prrsv感染的藥物，驗證了其具體功效。
2、為解決以上技術問題，本專利技術采用如下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在制備預防、治療prrsv感染的藥物中的應用，通過連接肽(h4)2將isg15與ifn-λ3連接起來，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
4、進一步地，所述藥物具有抑制prrsv的復制、抗prrsv活性的作用。
5、進一步地，所述藥物具有減輕肺臟病變的作用，對prrsv感染的仔豬有治療效果。
6、進一步地，所述藥物能夠改善仔豬的病毒血癥。
7、進一步地，所述藥物能夠減輕肺臟中的炎性因子的表達和分泌，具有良好的抗炎作用。
8、進一步地，編碼isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
9、進一步地，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：
10、1）將seq?id?no.2所示的核苷酸序列克隆到載體從而構建重組載體-isg15-(h4)2-ifn-λ3；
11、2）將重組載體-isg15-(h4)2-ifn-λ3轉化大腸桿菌從而得到用于制備isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的重組菌；
12、3）誘導表達獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。
13、更進一步地，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：
14、1）將seq?id?no.2所示的核苷酸序列克隆到pet-28a載體從而構建重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-ifn-λ3；
15、2）將重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-ifn-λ3轉化大腸桿菌bl21（de3）從而得到用于制備isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的重組菌；
16、3）誘導表達獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。
17、進一步地，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：將重組載體pet-28a-isg15-(h4)2-ifn-λ3轉化到感受態細胞bl21（de3）后得到重組菌，經誘導表達獲得isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白。
18、第二方面，提供預防、治療prrsv感染的藥物，所述藥物含有安全有效量的isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
19、進一步地，編碼isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
20、進一步地，所述藥物具有抑制prrsv的復制、抗prrsv活性的作用；或者所述藥物具有減輕肺臟病變的作用。
21、相對于現有技術，本專利技術的有益效果在于：
22、本專利技術選擇不同的連接肽：rl、hl、(h4)2，將isg15與ifn-λ3連接來促進isg15-ifn-λ3的生物活性，研究表明isg15與ifn-λ3通過rl和hl連接后，盡管蛋白表達量有所提升，但在pbs中大量析出，難以復性成功，使用(h4)2連接肽的isg15本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.?ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白在制備預防、治療PRRSV感染的藥物中的應用，其特征在于，通過連接肽(H4)2將ISG15與IFN-λ3連接起來，所述ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物具有抑制PRRSV的復制、抗PRRSV活性的作用。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物具有減輕肺臟病變的作用。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物能夠改善仔豬的病毒血癥。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物能夠減輕肺臟中的炎性因子的表達和分泌。
6.?根據權利要求1所述的應用，其特征在于，編碼ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
7.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白的制備方法包括如下步驟：
8.?預防、治療PRRSV感染的藥物，其特征在于，所述藥物
9.?根據權利要求8所述的藥物，其特征在于，編碼ISG15-(H4)2-IFN-λ3重組蛋白的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
10.根據權利要求9所述的藥物，其特征在于，所述藥物具有抑制PRRSV的復制、抗PRRSV活性的作用；或者所述藥物具有減輕肺臟病變的作用。
...【技術特征摘要】
1.?isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白在制備預防、治療prrsv感染的藥物中的應用，其特征在于，通過連接肽(h4)2將isg15與ifn-λ3連接起來，所述isg15-(h4)2-ifn-λ3重組蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示。
2.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物具有抑制prrsv的復制、抗prrsv活性的作用。
3.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物具有減輕肺臟病變的作用。
4.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物能夠改善仔豬的病毒血癥。
5.根據權利要求1所述的應用，其特征在于，所述藥物能夠減輕肺臟中的炎性因子的表達和分泌。
6.?根據權利要求1所述的應用，其特征在于，編碼isg15-(h...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭旭，南雨辰，武春燕，
申請(專利權)人：西北農林科技大學深圳研究院，
類型：發明
國別省市：
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