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    通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法技術

    技術編號:43751780 閱讀:7 留言:0更新日期:2024-12-20 13:09
    本發明專利技術公開了通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,本發明專利技術涉及腫瘤檢測技術領域。該通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,包括六個步驟,通過多重PCR技術和巢式PCR技術相結合,除了可以定性的檢測樣本是否出現甲基化,同時可以對甲基化的程度進行定量檢測,不僅能夠將基因甲基化信號放大,而且其所需要的檢測樣本起始量超低,測序成本較低,可檢出極其微量的甲基化DNA,從而使得早期篩查成為可能,通過合理選擇特異性的引物,可以進一步增加檢測的靈敏度和特異性,使其能夠檢測到很低的基因甲基化狀態,同時可排除非CpG區域甲基化對檢測的影響,剔除低轉化片段的干擾,提高檢出率。

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及腫瘤檢測,具體為通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法


    技術介紹

    1、肺癌從最初病變發展成癌浸潤轉移需要5-10年時間,早期發現不僅治療效果好,其醫療開支也低。但一旦突破這個階段,隨著病程變長,病變速度加快,治療費用高,效果很差。因此,早期診斷和治療是應對肺癌的最佳方法。由于肺癌早期沒有特異性的臨床表現,雖然有許多腫瘤早期信號出現,但是缺乏高敏感性和特異性的早期診斷技術,大多數患者確診時已經是癌癥晚期,如常見的磨玻璃為主的肺結節,它們的良惡性判斷最主要就是基于胸部ct影像的表現,但是很難給予鑒別,最終診斷往往是在中晚期。

    2、腫瘤的早期診斷通常取決于兩個關鍵因素:檢查指標的高靈敏度和無創、簡便的檢測方法。隨著科技的快速發展,腫瘤標志物已經發展成為腫瘤診斷和治療的新領域、新的挑戰和希望。腫瘤標志物可在體液或組織中檢測,可反映腫瘤的存在、分化程度、預后估計和治療效果。

    3、人體血液循環系統中不斷流動著血液細胞,體細胞和血液細胞破裂降解后,釋放胞漿中的內含物,包括蛋白質、外泌體、rna及攜帶有各種遺傳信息的dna片段即cfdna(cellfree?dna)。該類dna片段含有例如突變、缺失、插入、重排、拷貝數異常、甲基化等異常情況,特別是來自腫瘤基因組的ctdna(circulating?tumordna,循環腫瘤細胞dna)片段。ctdna由于獲取過程侵犯性低、可多次獲得、還可以觀察動態變化等被作為液體活檢的重要的檢測樣品。

    4、公開號為cn117512115a的專利技術公開了一種通過基因甲基化信號預放大提高檢測腫瘤靈敏率的方法,該方法為用亞硫酸氫鹽將樣品cfdna中非甲基化cpg位點進行轉化,之后用外側引物進行第一輪多道pcr擴增,pcr擴增產物純化后,用內側引物和探針進行第二輪pcr擴增,之后計算各個靶基因的dct(△ct)值,判斷樣品為陽性還是陰性。

    5、如上述專利技術所示,現有的提高檢測腫瘤靈敏率的方法將基因甲基化信號前置放大,以此來提高檢測準確率和靈敏度,但是這種方式在甲基化信號放大不明顯時,不能提高檢測準確率和靈敏度,影響檢測的效率。


    技術實現思路

    1、針對現有技術的不足,本專利技術提供了通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,解決了現有的問題。

    2、為實現以上目的,本專利技術通過以下技術方案予以實現:通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,包括以下步驟:

    3、步驟一:對待檢測組織dna樣本進行修飾處理,得到轉化后的dna;

    4、步驟二:使用內側引物對,采用多重pcr法對轉化后dna進行第一輪擴增,使得擴增的產物序列分別為dna轉化的正鏈和負鏈;

    5、步驟三:對獲得的第一輪擴增產物進行純化,去除非特異性擴增的小片段dna和二聚體;

    6、步驟四:使用外側引物對純化后的產物進行二次擴增,擴增后進行二次純化;

    7、步驟五:將二次擴增后的產物、特異性檢測引物和特異性探針進行rt-pcr反應

    8、步驟六:測量腫瘤組織dna甲基化標準品的ct值。

    9、優選的,所述亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾均可應用于步驟一中的修飾處理,用于將dna樣品中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶,而5’甲基化的胞嘧啶不變,從而區分甲基化或非甲基化基因片段。

    10、優選的,所述內側引物包括針對s2的甲基化的dna的正、負鏈分別設計而成的兩對引物,每對內側引物的5’端使用與外側引物的3’端互補的20~25個堿基,3’端使用根據目標靶點外側的序列所設計的特異性引物序列。

    11、優選的,通過所述內側引物的擴增方法為:將所有內側引物放入一個引物池中,在同一個反應體系內進行第一輪擴增,同時完成多個靶點基因的擴增。

    12、優選的,所述外側引物包括外側引物f和外側引物r,所述外側引物f與illuminamultiplexing?pcr?primer?1.0引物相同,所述外側引物r采用截斷了3’端的illumina?rnapcr?primer引物。

    13、優選的,所述特異性pcr檢測引物的序列如下:

    14、s-m-f(序列表中序列1):gatagttaggtaattttcgtttcg;

    15、s-m-r(序列表中序列2):ccttctaacccgacttaaacgacg;

    16、a-m-f(序列表中序列3):gggtggtgatggaggaggtt;

    17、a-m-r(序列表中序列4):taaccaccacccaacacacaat。

    18、優選的,所述特異性探針的序列如下:

    19、s-m-p(序列表中序列5):fam-gtacgaccccgatcg-mgb;

    20、a-m-p(序列表中序列6):vic-tggattgtgaatttgtg-mgb。

    21、優選的,所述rt-pcr反應的反應方法,包括以下步驟:

    22、s1:在95℃下保持3分鐘;

    23、s2:降溫至58℃,保持20秒;

    24、s3:升溫至72℃,保持30秒;

    25、s4:將步驟s2和步驟s3進行50次循環;

    26、s5:在72℃下保持1分鐘。

    27、有益效果

    28、本專利技術提供了通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法。

    29、與現有技術相比具備以下有益效果:

    30、1、該通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,通過多重pcr技術和巢式pcr技術相結合,除了可以定性的檢測樣本是否出現甲基化,同時可以對甲基化的程度進行定量檢測,不僅能夠將基因甲基化信號放大,而且其所需要的檢測樣本起始量超低,測序成本較低,可檢出極其微量的甲基化dna,從而使得早期篩查成為可能。

    31、2、該通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,通過合理選擇特異性的引物,可以進一步增加檢測的靈敏度和特異性,使其能夠檢測到很低的基因甲基化狀態,同時可排除非cpg區域甲基化對檢測的影響,剔除低轉化片段的干擾,提高檢出率。

    本文檔來自技高網...

    【技術保護點】

    1.通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于,包括以下步驟:

    2.根據權利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:所述亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾均可應用于步驟一中的修飾處理,用于將DNA樣品中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶,而5’甲基化的胞嘧啶不變,從而區分甲基化或非甲基化基因片段。

    3.根據權利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:所述內側引物包括針對S2的甲基化的DNA的正、負鏈分別設計而成的兩對引物,每對內側引物的5’端使用與外側引物的3’端互補的20~25個堿基,3’端使用根據目標靶點外側的序列所設計的特異性引物序列。

    4.根據權利要求3所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:通過所述內側引物的擴增方法為:將所有內側引物放入一個引物池中,在同一個反應體系內進行第一輪擴增,同時完成多個靶點基因的擴增。

    5.根據權利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:所述外側引物包括外側引物F和外側引物R,所述外側引物F與illuminaMultiplexing?PCR?Primer?1.0引物相同,所述外側引物R采用截斷了3’端的illumina?RNAPCR?Primer引物。

    6.根據權利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:所述特異性PCR檢測引物的序列如下:

    7.根據權利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:所述特異性探針的序列如下:

    8.根據權利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:所述RT-PCR反應的反應方法,包括以下步驟:

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    【技術特征摘要】

    1.通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于,包括以下步驟:

    2.根據權利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:所述亞硫酸氫鹽、重亞硫酸氫鹽或肼鹽修飾均可應用于步驟一中的修飾處理,用于將dna樣品中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶,而5’甲基化的胞嘧啶不變,從而區分甲基化或非甲基化基因片段。

    3.根據權利要求1所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:所述內側引物包括針對s2的甲基化的dna的正、負鏈分別設計而成的兩對引物,每對內側引物的5’端使用與外側引物的3’端互補的20~25個堿基,3’端使用根據目標靶點外側的序列所設計的特異性引物序列。

    4.根據權利要求3所述的通過基因甲基化信號預放大提高腫瘤檢測靈敏度的方法,其特征在于:通過所述內側引物的擴增方法為:將所有內側引物放入一...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:王楊馮磊孟明耀匡野郭洋帆李琳
    申請(專利權)人:昆明市延安醫院昆明市干部療養院
    類型:發明
    國別省市:

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