【技術實現步驟摘要】
本公開涉及植物病毒檢測，尤其涉及檳榔相關病毒的多重rt-pcr檢測方法。
技術介紹
1、檳榔位居中國四大南藥之首，在海南種植面積接近300萬畝，已成為海南省最主要的熱帶經濟作物。目前海南省的檳榔因檳榔黃化?。▂ellow?leaf?disease，yld）發病的面積可能已達100萬畝以上，而且還在快速蔓延，造成大批檳榔樹死亡。研究發現，檳榔黃化病與檳榔黃化病毒（apv1，areca?palm?velarivirus?1）、檳榔壞死梭斑病毒（anssv，arecapalm?spindle-spot?virus）、檳榔壞死環斑病毒（anrsv，areca?palm?necrotic?ringspotvirus）相關。其中，apv1病毒屬于velarivirus病毒屬病毒，該病毒病的發生與檳榔黃葉病有極高的相關性。anssv具potyviridae病毒的典型基因組和線體特征，屬于檳榔病毒屬（arepavirus），該病毒會使檳榔患檳榔壞死梭斑病毒?。╝reca?palm?spindle-spotdisease，anssd），該病害發病特征為植株頂部葉片呈條狀褪綠，中部和底部葉片出現嚴重紡錘狀壞死斑。感染anrsv會使檳榔患檳榔壞死環斑?。╝reca?palm?necrotic?ringspotdisease，anrsd），這種病害在檳榔主栽區內高度流行，檳榔感病后，感病樹的癥狀多為中部和下部葉片的壞死環斑，但大部分頂部新葉沒有出現這種癥狀；一些感病樹在新葉的底部有壞死的環斑出現。感染植株整體樹體活力差，葉片稀疏，底部葉片下垂，莖干比健
2、目前常見的植物病毒檢測方法有電鏡法、血清學鑒定和pcr技術等。電鏡檢測具有直觀、快速的優點，但檢測精確性不夠，只能根據病毒形態輔助判斷病毒屬，不能精確到種。血清學鑒定具有操作簡單、快速、靈敏性高、特異性強等特點，缺點是抗血清的制備時間較長；受自身抗體、非特異性抗體等干擾，易出現假陽性；檢測復合侵染的病毒時，靈敏度下降，鑒定比較有難度。pcr技術具有較強的特異性、較高的敏感性和準確性，其中rt-pcr（反轉錄pcr）的靈敏度和精確度比傳統血清學方法高，但是單重的rt-pcr技術單次只能檢測一種病毒，當需要對樣品進行多種病毒檢測時，需要大量的重復工作，同時又會消耗大量的檢測試劑。
3、基于此，有必要提供一種能同時快速檢測多種病原的方法，以方便檢出檳榔中多種病毒的侵染情況。
技術實現思路
1、本公開提供了檳榔相關病毒的多重rt-pcr檢測方法，以至少解決現有技術中存在的以上技術問題。
2、根據本公開的第一方面，提供了檳榔相關病毒的多重rt-pcr檢測的引物組，所述檳榔相關病毒包括apv1、anrsv和anssv；所述引物組包括：
3、檢測apv1的第一引物組：apv1-f，其核酸序列如seq?id?no:1：atcgctaaatattatggatagactt所示；apv1-r，其核酸序列如seq?id?no:2：tattcagaagcataagattgtgaca所示；
4、檢測anrsv的第二引物組：anrsv-f，其核酸序列如seq?id?no:3：caagtgaaagcctggg所示；anrsv-r，其核酸序列如seq?id?no:4：ccatgttcatactcactaacatc所示；
5、檢測anssv的第三引物組：anssv-f，其核酸序列如seq?id?no:5：tggccttttcgcaaacaagt所示；anssv-r，其核酸序列如seq?id?no:6：agctcgcaaaattctatcacct所示。
6、根據本公開的第二方面，提供了檳榔相關病毒的多重rt-pcr檢測的試劑盒，所述試劑盒包括pcr反應液，所述pcr反應液包括上述引物組。
7、在一可實施方式中，所述pcr反應液還包括premix?taq、cdna和水。
8、在一可實施方式中，所述pcr反應液為：premix?taq?15μl，apv1-f和apv1-r各0.5μl，anrsv-f和anrsv-r各0.4μl，anssv-f和anssv-r各1μl，cdna?3μl，水補齊至總體系為25μl。
9、在一可實施方式中，所述試劑盒還包括rt（反轉錄）反應液，所述rt反應液包括隨機引物[oligo(dt)?primer]、檳榔葉片的總rna、dntp?mixture、5×prime?scripttmbuffer、rnase?inhibitor、prime?scripttmrtase和水。
10、在一可實施方式中，所述rt反應液為：隨機引物5μl，檳榔葉片的總rna?4μl，10mmol/l的dntp?mixture?2μl，5×prime?scripttmbuffer?8μl，40u/μl的rnase?inhibitor1μl，prime?scripttmrtase?1μl，rnase?free水4μl。
11、在一可實施方式中，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
12、具體地，所述陽性對照為包括apv1、anrsv和anssv的目的片段的質粒的混合質粒。
13、具體地，所述陰性對照為健康的檳榔葉片的dna。
14、根據本公開的第三方面，提供了上述試劑盒在同時檢測檳榔相關病毒apv1、anrsv和anssv中的應用。
15、在一可實施方式中，所述應用的方法如下：
16、s1：提取檳榔葉片的總rna；
17、s2：以步驟s1所述總rna為模板，進行反轉錄，得cdna；
18、s3：以步驟s2所述cdna為模板，利用pcr反應液進行多重pcr擴增，得擴增產物；
19、s4：將所述擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若出現一條以上條帶，則判斷所述檳榔葉片中含有apv1、anrsv和anssv中的至少一種。
20、在一可實施方式中，步驟s2通過rt反應液進行所述反轉錄。
21、在一可實施方式中，步驟s2先將所述rt反應液中的隨機引物、檳榔葉片的總rna、dntp?mixture混合，于65℃變性5min，然后冰浴5min；再加入5×prime?scripttmbuffer、rnase?inhibitor、prime?scripttmrtase和水，于42℃反應60min，95℃反應5min后完成所述反轉錄。
22、在一可實施方式中，步驟s3所述多重pcr擴增的條件為：94℃，5min；94℃變性30s，53.4~57.3℃退火并延伸1min，共35~40個循環；72℃，10min。
23、在一可本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.檳榔相關病毒的多重RT-PCR檢測的引物組，其特征在于，所述檳榔相關病毒包括APV1、ANRSV和ANSSV；所述引物組包括：
2.檳榔相關病毒的多重RT-PCR檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括PCR反應液，所述PCR反應液包括權利要求1所述引物組。
3.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述PCR反應液還包括Premix?Taq、cDNA和水。
4.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括RT反應液，所述RT反應液包括隨機引物、檳榔葉片的總RNA、dNTP?Mixture、5×Prime?ScriptTM?Buffer、RNaseInhibitor、Prime?ScriptTM?RTase和水。
5.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為包括APV1、ANRSV和ANSSV的目的片段的質粒的混合質粒；所述陰性對照為健康的檳榔葉片的DNA。
6.權利要求2~5任一項所述試劑盒在同時檢測檳榔相關病毒APV1、ANRSV和ANSSV中的應用。p>
7.根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述應用的方法如下：
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，步驟S2通過RT反應液進行所述反轉錄；步驟S2先將所述RT反應液中的隨機引物、檳榔葉片的總RNA、dNTP?Mixture混合，于65℃變性5min，然后冰浴5min；再加入5×Prime?ScriptTM?Buffer、RNase?Inhibitor、PrimeScriptTM?RTase和水，于42℃反應60min，95℃反應5min后完成所述反轉錄。
9.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，步驟S3所述多重PCR擴增的條件為：94℃，5min；94℃變性30s，53.4~57.3℃退火并延伸1min，共35~40個循環；72℃，10min。
10.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，步驟S4中，若所述一條以上條帶與陽性對照的條帶大小相同，則判斷所述檳榔葉片中含有APV1、ANRSV和ANSSV中的至少一種。
...【技術特征摘要】
1.檳榔相關病毒的多重rt-pcr檢測的引物組，其特征在于，所述檳榔相關病毒包括apv1、anrsv和anssv；所述引物組包括：
2.檳榔相關病毒的多重rt-pcr檢測的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括pcr反應液，所述pcr反應液包括權利要求1所述引物組。
3.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述pcr反應液還包括premix?taq、cdna和水。
4.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括rt反應液，所述rt反應液包括隨機引物、檳榔葉片的總rna、dntp?mixture、5×prime?scripttm?buffer、rnaseinhibitor、prime?scripttm?rtase和水。
5.根據權利要求2所述試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照；所述陽性對照為包括apv1、anrsv和anssv的目的片段的質粒的混合質粒；所述陰性對照為健康的檳榔葉片的dna。
6.權利要求2~5任一項所述試劑盒在同時檢測...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王洪星，萬思宇，黃惜，孫可馨，
申請(專利權)人：海南大學三亞南繁研究院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。