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    一種人臍帶間充質(zhì)干細胞及外泌體的制備方法和應(yīng)用技術(shù)
    
                            
    技術(shù)編號：43766369 閱讀：24 留言：0更新日期：2024-12-24 16:07
    
                        
    
                        
    
                            
                            本發(fā)明專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細胞及外泌體的制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明專利技術(shù)通過博來霉素誘導系統(tǒng)性硬化癥模型小鼠，將制備的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體對系統(tǒng)性硬化癥模型小鼠進行干預(yù)治療，MSC及MSC?exo能夠顯著抑制SSc小鼠肺臟及皮膚組織中炎性細胞的浸潤，抑制纖維化指標HYP、α?SMA的表達，使SSc小鼠脾臟浸潤的CD4<supgt;+</supgt;CD25<supgt;+</supgt;FoxP3<supgt;+</supgt;T調(diào)節(jié)性T淋巴細胞（Treg）明顯升高，調(diào)節(jié)了SSc模型小鼠脾臟浸潤CD11b<supgt;+</supgt;F4/80<supgt;+</supgt;總巨噬細胞的分化以及CD11c<supgt;+</supgt;F4/80<supgt;+</supgt;M1型巨噬細胞和CD163<supgt;+</supgt;F4/80<supgt;+</supgt;M2型巨噬細胞比例。
    
                            
                            
    


    
                            

                            
    【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
    
                                
    本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥，特別是涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細胞及外泌體的制備方法和應(yīng)用。

    技術(shù)介紹
    1、系統(tǒng)性硬化癥（ssc）是一種病因和發(fā)病機制尚不明確的難治性自身免疫性疾病，進行性皮膚及多臟器纖維化是其最突出特征。
    2、流行病學研究顯示，ssc發(fā)病率僅為0.6/100萬～122/100萬，屬于罕見疾病。本病呈世界性分布，好發(fā)于30～50歲年齡段，女性發(fā)病率高于男性，男女比例約為1：（3～14），且致死致殘率高、預(yù)后較差，目前尚無有效治愈手段。因此，研發(fā)有效治療策略是該研究領(lǐng)域亟待解決的難題。

    技術(shù)實現(xiàn)思路
    1、本專利技術(shù)的目的在于提供一種人臍帶間充質(zhì)干細胞及外泌體的制備方法和應(yīng)用，以解決上述
    技術(shù)介紹
    中提出的問題。
    2、為達到上述技術(shù)目的，本專利技術(shù)的技術(shù)方案：
    3、一種人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述人臍帶間充質(zhì)干細胞的制備方法包括以下步驟：
    4、s11、無菌條件下獲取臍帶，清理臍帶內(nèi)動靜脈血浸泡于無菌生理鹽水中，用無菌剪刀將臍帶分為3~4cm小段，用手術(shù)刀剝離外膜并刮取華通氏膠；
    5、s12、將華通氏膠剪碎成1~3mm的組織碎塊用15ml?f12/dmem培養(yǎng)基重懸后加入t-75cm2培養(yǎng)瓶中，保證其均勻分布并占培養(yǎng)瓶底面積的40%~50%，待細胞融合度達到培養(yǎng)瓶底面積的80%~90%，可將細胞進行傳代培養(yǎng)，所述f12/dmem培養(yǎng)基中含有10%的fbs和1%的雙抗；
    6、s13、棄培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞上清，用1×pbs清洗，然后加入1ml胰蛋白酶消化3min后加入1ml?f12/dmem完全培養(yǎng)基終止消化，收集細胞置于15ml離心管中，在12rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，離心結(jié)束后，收集細胞沉淀即得到人臍帶間充質(zhì)干細胞；
    7、所述人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體是通過將人臍帶間充質(zhì)干細胞超高速離心制得。
    8、作為一種改進，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療皮膚組織中膠原沉積藥物中的應(yīng)用。
    9、作為進一步改進，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)皮膚組織中殼多糖酶3樣蛋白1及α-平滑肌肌動蛋白表達藥物中的應(yīng)用。
    10、作為進一步改進，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)脾臟浸潤調(diào)節(jié)性t細胞比例藥物中的應(yīng)用，所述調(diào)節(jié)性t細胞為cd4+cd25+foxp3+treg細胞。
    11、作為進一步改進，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)cd11b+f4/80+巨噬細胞分化藥物中的應(yīng)用。
    12、作為進一步改進，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)皮膚組織中羥脯氨酸藥物中的應(yīng)用。
    13、作為進一步改進，所述人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體的制備方法具體步驟為：
    14、s21、從液氮罐中取出人臍帶間充質(zhì)干細胞的細胞凍存管，在37℃的恒溫水浴鍋中水浴3min后移至15ml離心管中，用1×pbs加滿吹打洗滌，在1200rpm轉(zhuǎn)速下離心5min，棄上清得到間充質(zhì)干細胞；
    15、s22、將間充質(zhì)干細胞用1ml?baso無血清細胞培養(yǎng)基重懸后加入t-75培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)三天后收集上清液，通過超高速離心法獲取外泌體。
    16、作為進一步改進，所述超高速離心法的具體步驟如下：在4℃條件下，將上清液在10000g的轉(zhuǎn)速下超速離心30min，然后在120000g的轉(zhuǎn)速下超速離心70min，棄上清，然后用1×pbs重懸后在120000g的轉(zhuǎn)速下超速離心70min得到人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體。
    17、作為進一步改進，所述baso無血清細胞培養(yǎng)基中含有5%?ultragrotm-advanced和1%雙抗。
    18、由于采用上述技術(shù)方案，本專利技術(shù)的有益效果：
    19、本專利技術(shù)提供的一種人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，通過博來霉素誘導系統(tǒng)性硬化癥模型小鼠，將制備的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體對系統(tǒng)性硬化癥模型小鼠進行干預(yù)治療，msc及msc-exo能夠顯著抑制ssc小鼠肺臟及皮膚組織中炎性細胞的浸潤，抑制纖維化指標hyp、α-sma的表達。
    20、與ssc小鼠相比，接受msc、msc-exo治療的ssc小鼠脾臟浸潤的cd4+cd25+foxp3+?t調(diào)節(jié)性t淋巴細胞（treg）明顯升高，并且調(diào)節(jié)了ssc模型小鼠脾臟浸潤cd11b+f4/80+總巨噬細胞的分化以及cd11c+f4/80+?m1型巨噬細胞和cd163+f4/80+?m2型巨噬細胞比例，顯著改善炎癥及纖維化。
    21、經(jīng)msc及msc-exo干預(yù)后可明顯降低皮膚及肺臟chi3l1的表達，緩解其纖維化程度，msc及msc-exo對系統(tǒng)性硬化癥均具有良好的治療效果。
    本文檔來自技高網(wǎng)    ...
                            
    
                            
    【技術(shù)保護點】
    
                                
    1.一種人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述人臍帶間充質(zhì)干細胞的制備方法包括以下步驟：
    2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療皮膚組織中膠原沉積藥物中的應(yīng)用。
    3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)皮膚組織中殼多糖酶3樣蛋白1及α-平滑肌肌動蛋白表達藥物中的應(yīng)用。
    4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)脾臟浸潤調(diào)節(jié)性T細胞比例藥物中的應(yīng)用，所述調(diào)節(jié)性T細胞為CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞。
    5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)CD11b+F4/80+巨噬細胞分化藥物中的應(yīng)用。
    6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)皮膚組織中羥脯氨酸藥物中的應(yīng)用。
    7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體的制備方法具體步驟為：
    8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述超高速離心法的具體步驟如下：在4℃條件下，將上清液在10000g的轉(zhuǎn)速下超速離心30min，然后在120000g的轉(zhuǎn)速下超速離心70min，棄上清，然后用1×PBS重懸后在120000g的轉(zhuǎn)速下超速離心70min得到人臍帶間充質(zhì)干細胞外泌體。
    9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述Baso無血清細胞培養(yǎng)基中含有5%?UltraGROTM-Advanced和1%雙抗。
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    【技術(shù)特征摘要】
    
                                
    1.一種人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述人臍帶間充質(zhì)干細胞的制備方法包括以下步驟：
    2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療皮膚組織中膠原沉積藥物中的應(yīng)用。
    3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)皮膚組織中殼多糖酶3樣蛋白1及α-平滑肌肌動蛋白表達藥物中的應(yīng)用。
    4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)脾臟浸潤調(diào)節(jié)性t細胞比例藥物中的應(yīng)用，所述調(diào)節(jié)性t細胞為cd4+cd25+foxp3+treg細胞。
    5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人臍帶間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備治療系統(tǒng)性硬化癥藥物中的應(yīng)用，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞及其外泌體在制備調(diào)節(jié)cd11b+f4...
                            
    
                            
    【專利技術(shù)屬性】
    
                                技術(shù)研發(fā)人員：徐棟花，王惠，楊春娟，張進，曲卓見，孫文昌，藏潔，褚錦錦，
    
        申請(專利權(quán))人：濰坊市人民醫(yī)院濰坊市公共衛(wèi)生臨床中心，
    
        類型：發(fā)明
    
        國別省市：
    
                            
    
                            
                        
    
                    
    
                    
                    
                     
                
    
                
                
    
                    
    
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