【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及屬于基因工程和發酵工程，尤其涉及一種高效合成四氫嘧啶的基因工程菌及其構建方法。
技術介紹
1、四氫嘧啶是一種存在于微生物中的氨基酸衍生物，具體屬于環狀氨基酸，四氫嘧啶主要存在于中度嗜鹽細菌中，如嗜鹽菌(halomonas?elongata)和鏈霉菌屬、大腸桿菌等非嗜鹽菌中。四氫嘧啶作為一種具有多種生物和醫學作用的天然物質，在化妝品、護膚品、醫藥等領域具有廣泛的應用前景。
2、目前四氫嘧啶的合成主要有兩種方法：化學合成法和生物合成法。化學合成法存在著很多問題，包括生產過程復雜、合成產率低、副產物多且與目標產物的化學性質相似、下游分離純化難度很高等。生物合成法主要采用酶催化法和發酵法，在生物發酵法中，需要在菌體中構建四氫嘧啶的生物代謝通路。四氫嘧啶的合成過程可由三步完成，首先，天冬氨酸激酶(lysc)催化天冬氨酸生成β-天冬氨酰磷酸；隨后天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)催化β-天冬氨酰磷酸生成天冬氨酸-β-半醛；最后天冬氨酸-β-半醛在ectabc編碼的3種酶的催化作用下完成四氫嘧啶的合成。
3、近些年來，通過基因及代謝工程改造大腸桿菌生產四氫嘧啶的研究有較多的報道，但大多數在構建大腸桿菌四氫嘧啶代謝通路的研究中，通常采用加強目標產物路徑的強度的手段，但這樣的通路建設往往會影響其他支路的代謝，進而影響整個菌體對目標產量的增長。例如，從草酰乙酸到天冬氨酸的代謝途徑和從天冬氨酸-β-半醛到2,4-二氨基丁酸的代謝途徑均需要谷氨酸的參與，如果降低谷氨酸代謝支路，必然會影響到2,4-二氨基丁酸代謝，從而影響
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于克服現有技術的不足之處而提供一種不會影響其他必要產物的代謝通路且能高效合成四氫嘧啶的基因工程菌及其構建方法。
2、為實現上述目的，本專利技術采取的技術方案為：
3、第一方面，本專利技術提供了一種表達載體，所述表達載體包括天冬氨酸脫氫酶基因片段、谷氨酸脫氫酶基因片段和谷氨酸合酶基因片段。
4、本專利技術提供的表達載體可以調控宿主細胞中谷氨酸代謝通路，增加宿主體內谷氨酸的累積，從而進一步影響細胞中四氫嘧啶的生產能力。
5、作為本專利技術所述表達載體的優選實施方式，所述載體以雙啟動子質粒為骨架，所述天冬氨酸脫氫酶基因片段、谷氨酸脫氫酶基因片段和谷氨酸合酶基因片段串聯在雙啟動子質粒上，其中所述天冬氨酸脫氫酶基因片段連接到質粒雙啟動子的第一個啟動子后面，所述谷氨酸脫氫酶基因連接到質粒雙啟動子的第二個啟動子后面，谷氨酸合酶基因片段連接到連接到雙啟動子質粒的ncoi和bamhi之間。
6、作為本專利技術所述表達載體的優選實施方式，所述雙啟動子質粒為petduet-1。
7、作為本專利技術所述表達載體的優選實施方式，所述天冬氨酸脫氫酶基因為銅綠假單胞菌來源的aspdh基因或大腸桿菌來源的aspc基因，所述谷氨酸脫氫酶基因為枯草芽孢桿菌來源的rocg基因或大腸桿菌來源的gdha基因，所述谷氨酸合酶基因為大腸桿菌來源的gltb基因。
8、為了提高宿主細胞四氫嘧啶的產能，本專利技術眾多物種的天冬氨酸脫氫酶基因、谷氨酸脫氫酶基因、谷氨酸合酶基因篩選出銅綠假單胞菌來源的aspdh基因、大腸桿菌來源的aspc基因、枯草芽孢桿菌來源的rocg基因、大腸桿菌來源的gdha基因、大腸桿菌來源的gltb基因作為調控谷氨酸代謝通路中的關鍵酶基因，有助于谷氨酸在細胞中的累積，其余物種的其他天冬氨酸脫氫酶基因、谷氨酸脫氫酶基因、谷氨酸合酶基因均沒有本專利技術篩選出來的基因效果好。
9、作為本專利技術所述表達載體的優選實施方式，所述aspdh基因的序列如seq?id?no：16所示；所述aspc基因的gene?id為945553；所述rocg基因的gene?id為937066；所述gdha基因的gene?id為946802；所述gltb基因的gene?id為947724。
10、作為本專利技術所述表達載體的優選實施方式，所述天冬氨酸脫氫酶基因為銅綠假單胞菌來源的aspdh基因，所述谷氨酸脫氫酶基因為枯草芽孢桿菌來源的rocg基因。
11、本專利技術優化了谷氨酸代謝通路關鍵酶基因，將不同來源的酶基因進行了比較，發現銅綠假單胞菌來源的aspdh基因、枯草芽孢桿菌來源的rocg基因較其他來源的同類基因更能提高宿主細胞的產能。
12、第二方面，本專利技術提供一種基因工程菌，所述基因工程菌過表達基因簇ectabc、過表達天冬氨酸脫氫酶基因、過表達谷氨酸脫氫酶基因、過表達谷氨酸合酶基因，并弱表達谷氨酰胺連接酶基因。
13、本專利技術通過加強天冬氨酸脫氫酶基因、谷氨酸脫氫酶基因、谷氨酸合酶基因的表達提高合成四氫嘧啶通路上所必需的谷氨酸的含量，又通過弱化谷氨酰胺連接酶基因降低谷氨酸向谷氨酰胺的代謝途徑，從而保證了細胞內谷氨酸的含量，不僅提高四氫嘧啶的合成產量，還能保障細胞本身生長所需的谷氨酸。
14、作為本專利技術所述基因工程菌的優選實施方式，所述基因簇ectabc通過質粒prsfduet-1表達；通過質粒或基因組整合方法實現過表達所述天冬氨酸脫氫酶基因、谷氨酸脫氫酶基因和谷氨酸合酶基因，通過crispri基因編輯方法弱表達所述谷氨酰胺連接酶基因。
15、作為本專利技術所述基因工程菌的優選實施方式，所述crispri基因編輯方法弱表達所述谷氨酰胺連接酶基因方法如下：
16、s1.針對谷氨酰胺連接酶基因glna設計sgrnas-n20序列，所述sgrnas-n20序列為如seq?id?no:13～15所示的任一種；
17、s2.使用bsai酶切質粒pli-dcas9-sgrna使之線性化，之后連接上sgrnas序列片段，得質粒pli-dcas9-sgrna-glnas。
18、進一步地，所述crispri基因編輯方法弱表達所述谷氨酰胺連接酶基因方法，具體步驟為：
19、s1.分別針對谷氨酰胺連接酶基因glna的atg上游-34～-15bp、atg下游58～77bp、atg下游403～422bp三個區域設計sgrnas-n20序列，得到三條sgrnas-n20序列，分別為glnas1、glnas2、glnas3；所述glnas1序列如seq?id?no:13所示；所述glnas2序列如seq?idno:14所示；所述glnas3序列如seq?id?no:15所示；
20、s2.使用bsai酶切質粒pli-dcas9-sgrna使之線性化，之后分別連接上glnas1、glnas2、glnas3片段，得質粒pli-dcas9-sgrna-glnas1、pli-dcas9-sgrna-glnas2、pli-dcas9-sgrna-glnas3。
21、作為本專利技術所述基因工程菌的優選實施方式，所述天冬氨酸脫氫酶基因為銅綠假單胞菌來源的aspdh基因或大腸桿菌來源的aspc基因，所述谷氨酸脫氫酶基因為枯草芽孢桿菌來源的rocg本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體包括天冬氨酸脫氫酶基因片段、谷氨酸脫氫酶基因片段和谷氨酸合酶基因片段。
2.如權利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述載體以雙啟動子質粒為骨架，所述天冬氨酸脫氫酶基因片段、谷氨酸脫氫酶基因片段和谷氨酸合酶基因片段串聯在雙啟動子質粒上，其中所述天冬氨酸脫氫酶基因片段連接到質粒雙啟動子的第一個啟動子后面，所述谷氨酸脫氫酶基因連接到質粒雙啟動子的第二個啟動子后面，谷氨酸合酶基因片段連接到連接到雙啟動子質粒的NcoI和BamHI位點之間。
3.如權利要求2所述的表達載體，其特征在于，所述天冬氨酸脫氫酶基因為銅綠假單胞菌來源的aspDH基因或大腸桿菌來源的aspC基因，所述谷氨酸脫氫酶基因為枯草芽孢桿菌來源的rocG基因或大腸桿菌來源的gdhA基因，所述谷氨酸合酶基因為大腸桿菌來源的gltB基因。
4.如權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述aspDH基因的序列如SEQ?ID?NO：16所示；所述aspC基因的Gene?ID為945553；所述rocG基因的Gene?ID為937066；所述gdhA基因的G
5.如權利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述天冬氨酸脫氫酶基因為銅綠假單胞菌來源的aspDH基因，所述谷氨酸脫氫酶基因為枯草芽孢桿菌來源的rocG基因。
6.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌過表達基因簇ectABC、過表達天冬氨酸脫氫酶基因、過表達谷氨酸脫氫酶基因和過表達谷氨酸合酶基因，并弱表達谷氨酰胺連接酶基因。
7.如權利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因簇ectABC通過質粒過表達；通過質粒或基因組整合方法實現過表達所述天冬氨酸脫氫酶基因、谷氨酸脫氫酶基因和谷氨酸合酶基因，通過CRISPRi基因編輯方法弱表達所述谷氨酰胺連接酶基因。
8.如權利要求7所述的基因工程菌，其特征在于，所述CRISPRi基因編輯方法弱表達所述谷氨酰胺連接酶基因方法如下：
9.一種構建如權利要求6～8任一項所述的基因工程菌的方法，其特征在于，包括如下步驟：
10.權利要求1～5任一項所述的表達載體或6～8任一項所述的基因工程菌在制備四氫嘧啶中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種表達載體，其特征在于，所述表達載體包括天冬氨酸脫氫酶基因片段、谷氨酸脫氫酶基因片段和谷氨酸合酶基因片段。
2.如權利要求1所述的表達載體，其特征在于，所述載體以雙啟動子質粒為骨架，所述天冬氨酸脫氫酶基因片段、谷氨酸脫氫酶基因片段和谷氨酸合酶基因片段串聯在雙啟動子質粒上，其中所述天冬氨酸脫氫酶基因片段連接到質粒雙啟動子的第一個啟動子后面，所述谷氨酸脫氫酶基因連接到質粒雙啟動子的第二個啟動子后面，谷氨酸合酶基因片段連接到連接到雙啟動子質粒的ncoi和bamhi位點之間。
3.如權利要求2所述的表達載體，其特征在于，所述天冬氨酸脫氫酶基因為銅綠假單胞菌來源的aspdh基因或大腸桿菌來源的aspc基因，所述谷氨酸脫氫酶基因為枯草芽孢桿菌來源的rocg基因或大腸桿菌來源的gdha基因，所述谷氨酸合酶基因為大腸桿菌來源的gltb基因。
4.如權利要求3所述的表達載體，其特征在于，所述aspdh基因的序列如seq?id?no：16所示；所述aspc基因的gene?id為945553；所述rocg基因的gene?id為937066；所述gdha基因的gene?id...
【專利技術屬性】
技術研發人員：勞才文，沈慧敏，金憶文，夏沁怡，樊希杰，李賀，張啟宏，
申請(專利權)人：合肥中科健康生物產業技術研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
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