【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及屬于基因工程和發(fā)酵工程，尤其涉及一種高效合成四氫嘧啶的基因工程菌及其構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
1、四氫嘧啶是一種存在于微生物中的氨基酸衍生物，具體屬于環(huán)狀氨基酸，四氫嘧啶主要存在于中度嗜鹽細(xì)菌中，如嗜鹽菌(halomonas?elongata)和鏈霉菌屬、大腸桿菌等非嗜鹽菌中。四氫嘧啶作為一種具有多種生物和醫(yī)學(xué)作用的天然物質(zhì)，在化妝品、護(hù)膚品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
2、目前四氫嘧啶的合成主要有兩種方法：化學(xué)合成法和生物合成法。化學(xué)合成法存在著很多問(wèn)題，包括生產(chǎn)過(guò)程復(fù)雜、合成產(chǎn)率低、副產(chǎn)物多且與目標(biāo)產(chǎn)物的化學(xué)性質(zhì)相似、下游分離純化難度很高等。生物合成法主要采用酶催化法和發(fā)酵法，在生物發(fā)酵法中，需要在菌體中構(gòu)建四氫嘧啶的生物代謝通路。四氫嘧啶的合成過(guò)程可由三步完成，首先，天冬氨酸激酶(lysc)催化天冬氨酸生成β-天冬氨酰磷酸；隨后天冬氨酸半醛脫氫酶(asd)催化β-天冬氨酰磷酸生成天冬氨酸-β-半醛；最后天冬氨酸-β-半醛在ectabc編碼的3種酶的催化作用下完成四氫嘧啶的合成。同時(shí)賴氨酸和高絲氨酸的代謝路徑也是由天冬氨酸-β-半醛開(kāi)始的，因此與四氫嘧啶存在一定的碳流量代謝競(jìng)爭(zhēng)。
3、在現(xiàn)有研究中，對(duì)于與主表達(dá)代謝路徑存在代謝流競(jìng)爭(zhēng)路徑時(shí)，常用的做法是敲除支路的表達(dá)基因，以實(shí)現(xiàn)支路代謝流的完全截流。在四氫嘧啶的研究中常用的支路代謝截流方法是敲除賴氨酸表達(dá)基因lysa和高絲氨酸脫氫酶基因metl。這種做法在設(shè)計(jì)層面是合理的，但對(duì)于菌體生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)可能存在負(fù)面影響，菌體的生命代謝需要必須氨基酸，
4、因此，尋求一種不會(huì)影響其他必要產(chǎn)物的代謝通路且能高效合成四氫嘧啶的基因工程菌及其構(gòu)建方法成為本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)問(wèn)題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處而提供一種不會(huì)影響其他必要產(chǎn)物的代謝通路且能高效合成四氫嘧啶的基因工程菌及其構(gòu)建方法。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)采取的技術(shù)方案為：
3、第一方面，本專利技術(shù)提供一種蛋白降解標(biāo)簽(small?subunit?ribosomal?proteins1，ssra)，所述蛋白降解標(biāo)簽的氨基酸序列如seq?id?no：1～9所示的任一種。
4、作為本專利技術(shù)第一方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述蛋白降解標(biāo)簽的氨基酸序列如seq?idno：1～4所示的任一種。
5、第二方面，本專利技術(shù)提供一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包括雙啟動(dòng)子質(zhì)粒、二氨基庚二酸脫羧酶基因lysa片段、編碼蛋白降解標(biāo)簽a核酸片段、高絲氨酸脫氫酶基因metl片段和編碼蛋白降解標(biāo)簽b核酸片段；所述二氨基庚二酸脫羧酶基因lysa片段與編碼蛋白降解標(biāo)簽a核酸片段依次串聯(lián)位于雙啟動(dòng)子質(zhì)粒的第一個(gè)啟動(dòng)子后面，高絲氨酸脫氫酶基因metl片段與編碼蛋白降解標(biāo)簽b核酸片段依次串聯(lián)位于雙啟動(dòng)子質(zhì)粒的第二個(gè)啟動(dòng)子后面；所述編碼蛋白降解標(biāo)簽a核酸片段和編碼蛋白降解標(biāo)簽b核酸片段編碼出的氨基酸序列相同或不相同。
6、作為本專利技術(shù)第二方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述蛋白降解標(biāo)簽a或b分別獨(dú)立地選自蛋白降解標(biāo)簽laa、laa+2、laa+8、das+2、das+8以及其突變標(biāo)簽laa+2*、laa+8*、das+2*、das+8*中的任一種。
7、作為本專利技術(shù)第二方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述蛋白降解標(biāo)簽的氨基酸序列如下：
8、蛋白降解標(biāo)簽laa+2*的氨基酸序列如seq?id?no：1所示；
9、蛋白降解標(biāo)簽laa+8*的氨基酸序列如seq?id?no：2所示；
10、蛋白降解標(biāo)簽das+2*的氨基酸序列如seq?id?no：3所示；
11、蛋白降解標(biāo)簽das+8*的氨基酸序列如seq?id?no：4所示；
12、蛋白降解標(biāo)簽laa的氨基酸序列如seq?id?no：5所示；
13、蛋白降解標(biāo)簽laa+2的氨基酸序列如seq?id?no：6所示；
14、蛋白降解標(biāo)簽laa+8的氨基酸序列如seq?id?no：7所示；
15、蛋白降解標(biāo)簽das+2的氨基酸序列如seq?id?no：8所示；
16、蛋白降解標(biāo)簽das+8的氨基酸序列如seq?id?no：9所示。
17、作為本專利技術(shù)第二方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述蛋白降解標(biāo)簽的編碼核酸序列如下：
18、編碼seq?id?no：1序列的核酸序列如seq?id?no：10所示；
19、編碼seq?id?no：2序列的核酸序列如seq?id?no：11所示；
20、編碼seq?id?no：3序列的核酸序列如seq?id?no：12所示；
21、編碼seq?id?no：4序列的核酸序列如seq?id?no：13所示；
22、編碼seq?id?no：5序列的核酸序列如seq?id?no：14所示；
23、編碼seq?id?no：6序列的核酸序列如seq?id?no：15所示；
24、編碼seq?id?no：7序列的核酸序列如seq?id?no：16所示；
25、編碼seq?id?no：8序列的核酸序列如seq?id?no：17所示；
26、編碼seq?id?no：9序列的核酸序列如seq?id?no：18所示。
27、第三方面，本專利技術(shù)提供一種基因工程菌，所述基因工程菌含有過(guò)表達(dá)基因簇ectabc的表達(dá)載體和第二方面所述的表達(dá)載體。
28、第四方面，本專利技術(shù)提供一種所述基因工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
29、s1.將基因簇ectabc整合到prsfduet-1質(zhì)粒上，得到質(zhì)粒prsf-ectabc；
30、s2.將二氨基庚二酸脫羧酶基因lysa片段通過(guò)同源重組技術(shù)連接到質(zhì)粒petduet-1的第一個(gè)t7啟動(dòng)子后面，得到質(zhì)粒a；
31、s3.將高絲氨酸脫氫酶基因metl片段通過(guò)同源重組技術(shù)連接到質(zhì)粒a的第二個(gè)t7啟動(dòng)子后面，得到質(zhì)粒b；
32、s4.將所述步驟s1的質(zhì)粒和步驟s3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)宿主細(xì)胞中，將宿主細(xì)胞置于液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，得所述基因工程菌。
33、作為本專利技術(shù)第四方面的優(yōu)選實(shí)施方式，所述質(zhì)粒a含有l(wèi)ysa基因片段和編碼蛋白降解標(biāo)簽a核酸片段；所述質(zhì)粒b含有l(wèi)ysa基因片段、編碼蛋白降解標(biāo)簽a核酸片段、metl基因片段和編碼蛋白降解標(biāo)簽b核酸片段；所述蛋白降解標(biāo)簽a或b分別獨(dú)立地選自蛋白降解標(biāo)簽laa、laa+2、laa+8、das+2、das+8以及其突變標(biāo)簽laa+2*、laa+8*、das+2*、das+8*中的任一種；所述編碼蛋白降解標(biāo)簽a核酸片段的序列如seq?id?no：10～18所示；所述編碼蛋白降解標(biāo)簽b核酸片段的序列如seq?id?no：10～18所示；所述感受態(tài)宿主細(xì)胞本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種蛋白降解標(biāo)簽，其特征在于，所述蛋白降解標(biāo)簽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1～9所示的任一種。
2.如權(quán)利要1所述的蛋白降解標(biāo)簽，其特征在于，所述蛋白降解標(biāo)簽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1～4所示的任一種。
3.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包括雙啟動(dòng)子質(zhì)粒、二氨基庚二酸脫羧酶基因lysA片段、編碼蛋白降解標(biāo)簽A核酸片段、高絲氨酸脫氫酶基因metL片段和編碼蛋白降解標(biāo)簽B核酸片段；
4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述蛋白降解標(biāo)簽A或B分別獨(dú)立地選自蛋白降解標(biāo)簽LAA、LAA+2、LAA+8、DAS+2、DAS+8以及其突變標(biāo)簽LAA+2*、LAA+8*、DAS+2*、DAS+8*中的任一種。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述蛋白降解標(biāo)簽的氨基酸序列如下：
6.如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述蛋白降解標(biāo)簽的編碼核酸序列如下：
7.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有過(guò)表達(dá)基因簇ectABC的表達(dá)載體和權(quán)利要求3～6任一項(xiàng)所述的表達(dá)載體。
8.一種權(quán)利要求7所述基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
9.如權(quán)利要求8所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述質(zhì)粒A含有l(wèi)ysA基因片段和編碼蛋白降解標(biāo)簽A核酸片段；所述質(zhì)粒B含有l(wèi)ysA基因片段、編碼蛋白降解標(biāo)簽A核酸片段、metL基因片段和編碼蛋白降解標(biāo)簽B核酸片段；
10.一種制備四氫嘧啶的方法，其特征在于，使用權(quán)利要求7所述的基因工程菌進(jìn)行發(fā)酵的步驟。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種蛋白降解標(biāo)簽，其特征在于，所述蛋白降解標(biāo)簽的氨基酸序列如seq?id?no：1～9所示的任一種。
2.如權(quán)利要1所述的蛋白降解標(biāo)簽，其特征在于，所述蛋白降解標(biāo)簽的氨基酸序列如seq?id?no：1～4所示的任一種。
3.一種表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包括雙啟動(dòng)子質(zhì)粒、二氨基庚二酸脫羧酶基因lysa片段、編碼蛋白降解標(biāo)簽a核酸片段、高絲氨酸脫氫酶基因metl片段和編碼蛋白降解標(biāo)簽b核酸片段；
4.如權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述蛋白降解標(biāo)簽a或b分別獨(dú)立地選自蛋白降解標(biāo)簽laa、laa+2、laa+8、das+2、das+8以及其突變標(biāo)簽laa+2*、laa+8*、das+2*、das+8*中的任一種。
5.如權(quán)利要求4...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：金憶文，勞才文，沈慧敏，夏沁怡，李賀，樊希杰，張啟宏，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：合肥中科健康生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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