【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及體外診斷試劑領域，具體涉及一種體外擴增結核性胸水單核細胞的方法。
技術介紹
1、結核病目前仍然是一個全球性的公共衛生問題。tb-igra是以結核分枝桿菌特異抗原刺激t細胞產生的γ-干擾素（interferon-gamma，ifn-γ）為檢測靶標，對人體體液樣本中的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應進行體外檢測的方法（試劑），檢測過程大致分為抗原刺激和ifn-γ檢測兩部分。該類試劑已被廣泛應用于肺結核的臨床診斷和潛伏性結核感染的篩查監測，是實現who結核病消滅戰略的關鍵措施之一。隨著相關試劑的廣泛應用，國內外臨床醫療機構和藥品監管機構早已關注了該類產品的質量風險，但是參考物質的缺乏導致該試劑的質量控制和性能評價缺少有力的工具。
2、體外診斷試劑中的質控樣本是指，被其制造商預期用于驗證體外診斷試劑性能特征的物質、材料或物品。質控樣本的基本特性應滿足：第一，基質應盡可能與臨床實際檢驗的待測標本一致，以避免可能的“基質效應”的存在；第二，其所含待測物的濃度盡可能接近試驗的cut-off值或臨床決定性水平；第三，具有較好的穩定性和重復性。目前常使用新鮮采集的結核病患者全血作為參考物質（reference?material）進行tb-igra類試劑盒的產品研發、質量控制和性能評價等工作。但是新鮮采集的、具有適宜反應性的全血作為參考物質原料的來源受限而難以用于大量制備參考物質，也難以像血清血漿一樣采用冰凍或凍干方式保存。由于新鮮全血樣本存在來源不穩定（捐獻者流動）、難以長時間保存、單次采集量有限等問題，難以使用相同樣本進
3、基于以上背景，本專利技術旨在提供一種體外擴增結核性胸水單核細胞的方法，從而解決參考物質原料樣本來源不足且難以重復的難題，為研制tb-igra質量控制和性能評價用參考物質提供基礎。
技術實現思路
1、為了彌補現有技術的不足，本專利技術的目的在于提供一種體外擴增結核性胸水單核細胞的方法，其用于制備體外診斷試劑質量控制樣本的方法及應用。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用如下技術方案：
3、本專利技術第一方面提供了一種制備結核病體外診斷試劑參考物質的方法，所述方法包括：體外擴增結核性胸腔積液中的單個核細胞，在培養第4天，將培養基更換為非t細胞擴增培養基。
4、進一步，所述非t細胞擴增培養基為含10%胎牛血清和1%青鏈霉素混合液（100×）的rpmi-1640培養基。
5、在本專利技術中，參考物質是指一種穩定的物質，用于檢查分析儀器、方法或試劑的性能。通常是不專為特定試劑盒或儀器設定的或者調整優化的，可以對試劑盒、檢測系統提供性能監測的一類質控物質。參考物質的成分應與檢測患者樣本的基質相似或一樣。理想的基質是使用人血清、尿液、或腦脊液等。參考物質應該均一和穩定，條件允許，可儲存一年的用量。瓶間變異性應小于分析系統的變異。參考物質可以是商品的參考物質或實驗室可以自制的參考物質，可以是液體的或凍干的材料，內含一個或多個已知濃度或已知量的組分。
6、在本專利技術中，胸腔積液為胸膜腔內病理性液體積聚為特征的一種常見臨床癥候，可以是漏出性胸腔積液或滲出性胸腔積液。
7、進一步，所述結核病包括由結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌或結核分枝桿菌復合群感染引發的疾病。
8、進一步，所述結核病包括呼吸系統結核、泌尿系統結核、消化系統結核、生殖系統結核、骨與關節結核。
9、進一步，所述呼吸系統結核通常為肺結核，可以是原發性肺結核；血行播散性肺結核；繼發性肺結核；氣管、支氣管結核；結核性胸膜炎。所述泌尿系統結核可以是腎結核；輸尿管結核；膀胱結核；尿道結核；繼發于肺結核的泌尿系統結核。所述消化系統結核可以是潰瘍型腸結核；增生型腸結核；腸外結核；結核性腹膜炎；繼發于肺結核的消化系統結核。所述生殖系統結核可以是輸卵管結核；子宮內膜結核；宮頸結核；卵巢結核；結核性輸卵管內膜炎；繼發于肺結核的生殖系統結核。所述骨與關節結核可以是脊柱結核；髖關節結核；膝關節結核；繼發于肺結核的骨與關節結核。
10、進一步，所述結核病體外診斷試劑為通過igra試驗進行體外診斷的試劑。
11、igra試驗又稱tb-igra，是指以結核分枝桿菌特異抗原刺激t細胞產生的γ-干擾素（interferon-gamma，ifn-γ）為檢測靶標，對人體體液樣本中的結核分枝桿菌特異性細胞免疫反應進行體外檢測的方法。是世界衛生組織推薦的用于診斷結核分枝桿菌感染的體外免疫學方法，也是我國肺結核診斷標準中用于活動性結核輔助診斷的手段之一。
12、進一步，所述結核病體外診斷試劑包括通過elispot和/或elisa進行體外診斷時所用的試劑。
13、進一步，所述結核病體外診斷試劑包括t-spot.tb、quantiferon.tb中的一種或多種。
14、本專利技術第二方面提供了一種體外擴增結核性胸腔積液單個核細胞的方法，所述方法的步驟包括：用淋巴細胞分離液處理結核性胸腔積液，分離單個核細胞，用t細胞擴增培養基重懸，在包被有cd3單抗的培養皿中進行后續培養。
15、進一步，所述用淋巴細胞分離液處理是指將結核性胸腔積液緩慢加至淋巴細胞分離液上層，結核性胸腔積液和淋巴細胞分離液的體積比為4:1，離心后收集白膜層，獲得單個核細胞。
16、進一步，所述離心的條件為800?g，30?min。
17、進一步，所述單個核細胞在分離后可以直接進行后續培養，或凍存后復蘇進行后續培養。
18、進一步，所述凍存的步驟包括：用凍存液稀釋，調整細胞濃度，程序降溫。
19、進一步，所述凍存液的組分為胎牛血清和dmso。
20、進一步，所述凍存液的組分中胎牛血清和dmso的含量為4:1。
21、進一步，所述調整細胞濃度是指將細胞濃度調整至1×107/ml。
22、進一步，所述t細胞擴增培養基包括基礎培養基和添加劑。
23、進一步，所述基礎培養基選自rpmi-1640培養基、aim-v培養基、x-vivo培養基、t-vivo培養基、dmem/f12培養基中的至少一種。
24、進一步，所述基礎培養基為rpmi-1640培養基。
25、進一步，所述添加劑包括血清、抗生素、生長因子、功能性抗體、無機鹽、還原劑、胰島素、氨基酸中的一種或多種。
26、進一步，所述添加劑包含血清、抗生素、生長因子、功能性抗體。
27、在本專利技術中，添加劑是指被設計用于促進多種微生物培養的補充劑、營養素和其他富集制劑。血清是培養基中的關鍵添加劑之一，通常是動物血清，例如人血清、牛來源血清。在一些實施例中，血清可以是人血清、胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
28、生長因子是細胞信號蛋白，在細胞增殖、分化和本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種制備結核病體外診斷試劑參考物質的方法，其特征在于，所述方法包括：體外擴增結核性胸腔積液中的單個核細胞，在培養第4天，將培養基更換為非T細胞擴增培養基；
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述結核病包括由結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌或結核分枝桿菌復合群感染引發的疾病；
3.一種體外擴增結核性胸腔積液單個核細胞的方法，其特征在于，所述方法的步驟包括：用淋巴細胞分離液處理結核性胸腔積液，分離單個核細胞，用T細胞擴增培養基重懸，在包被有CD3單抗的培養皿中進行后續培養。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述用淋巴細胞分離液處理是指將結核性胸腔積液緩慢加至淋巴細胞分離液上層，結核性胸腔積液和淋巴細胞分離液的體積比為4:1，離心后收集白膜層，獲得單個核細胞；
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述單個核細胞在分離后可以直接進行后續培養，或凍存后復蘇進行后續培養；
6.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述T細胞擴增培養基包括基礎培養基和添加劑；
7.利用權利要
8.一種結核病體外診斷試劑的參考物質，其特征在于，所述參考物質是利用權利要求1或2所述的方法制備獲得，或，所述參考物質包含權利要求7所述的單個核細胞。
9.權利要求7所述的單個核細胞或權利要求8所述的參考物質的應用，其特征在于，所述應用包括如下任一種：
10.根據權利要求9所述的應用，其特征在于，所述結核病體外診斷產品可以是試劑盒、診斷儀器、微流控芯片。
...【技術特征摘要】
1.一種制備結核病體外診斷試劑參考物質的方法，其特征在于，所述方法包括：體外擴增結核性胸腔積液中的單個核細胞，在培養第4天，將培養基更換為非t細胞擴增培養基；
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述結核病包括由結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌或結核分枝桿菌復合群感染引發的疾病；
3.一種體外擴增結核性胸腔積液單個核細胞的方法，其特征在于，所述方法的步驟包括：用淋巴細胞分離液處理結核性胸腔積液，分離單個核細胞，用t細胞擴增培養基重懸，在包被有cd3單抗的培養皿中進行后續培養。
4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述用淋巴細胞分離液處理是指將結核性胸腔積液緩慢加至淋巴細胞分離液上層，結核性胸腔積液和淋巴細胞分離液的體積比為4:1，離心后收集白膜層...
【專利技術屬性】
技術研發人員：蔣德云，石大偉，許四宏，陳婷梅，
申請(專利權)人：重慶醫科大學國際體外診斷研究院，
類型：發明
國別省市：
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