【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物和酶工程領域，涉及一系列具有高熱穩定性的溶葡萄球菌酶突變體及其制備方法和應用。
技術介紹
1、溶葡萄球菌酶(lst)是擬葡萄球菌合成的一種鋅離子依賴型的肽酶，其可有效的切割細菌細胞壁肽聚糖交聯結構甘氨酸五肽橋中的第2位和第3位甘氨酸形成的肽鍵，從而起到溶壁殺菌的作用。因此該蛋白具有特異性，可特異性的殺死金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和溶血性葡萄球菌。目前國內、外研究人員利用基因重組技術已將此酶成功表達于多種工程菌中，并且國內已批準溶葡萄球菌酶一批新藥臨床實驗，可應用于醫藥、美妝、食品、黏膜消毒、口腔護理、私護、獸藥、寵物護理等多個領域，具有強大的市場潛力。
2、酶的熱穩定性表征酶分子在高溫下維持自身結構和活性的能力，是評價酶應用價值的重要標準。熱穩定的酶具有提高化學反應速率、簡化工藝、降低成本、提高產品質量，活性穩定和耐儲藏的優點。所以提高溶葡萄球菌酶的熱穩定性一直是科研和生產關注的熱點，也是限制其擴大應用場景的重要因素。
3、基于以上背景，本專利技術通過理性設計獲得一系列高熱穩定性的溶葡萄球菌酶，為后續的生產和擴寬應用場景奠定了基礎。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供一系列高穩定性的溶葡萄球菌酶突變體，及其制備方法和應用，以解決目前存在的熱穩定性問題。
2、為了實現以上目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、本專利技術提供了一種高熱穩定性的溶葡萄球菌酶突變體，野生型溶葡萄球菌酶的氨基酸序列為seq?id?n
4、進一步地，所述溶葡萄球菌酶包括不限于seq?id?no.1所示的序列，還包括截短形式的序列。
5、進一步地，所述包含多個突變位點的突變體優選自以下位點的組合，包括但不局限于以下突變體：k45y/y85f；k45y/n120g；k45y/s190a；y85f/s190a；y85f/s190w；y85f/m131l；y85f/n120g；n120g/s190a；k45y/y85f/n120g；y85f/n120g/s190a；y85f/m131l/s190a；y85f/n120g/m131l。
6、本專利技術還提供了一種上述突變體的表達載體，包括但不局限于pet30a+。
7、本專利技術還提供了一種表達上述突變體的重組菌株。
8、進一步地，所述重組菌株優選大腸桿菌，但不局限于大腸桿菌，還可以是其他的原核細胞或真核細胞。
9、更進一步地，所述真核細胞包括畢赤酵母；所述原核細胞包括乳酸乳球菌、枯草芽孢桿菌、葡萄球菌和鏈球菌。
10、本專利技術還提供了上述突變體的制備方法，包括以下步驟：利用定點突變構建突變體表達載體，轉入大腸桿菌bl21(de3)感受態中并進行誘導表達。離心收菌超聲破碎，取上清經ni柱純化，超濾管濃縮脫鹽。
11、本專利技術還提供了上述突變體、多聚核苷酸分子、重組表達載體、宿主細胞在抗葡萄球菌領域中的應用。
12、進一步地，所述葡萄球菌包括但不限于表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、盧格敦葡萄球菌、腐生葡萄球菌和金黃色葡萄球菌。
13、有益效果在于，本專利技術基于結構分析，結合多種熱穩定性設計軟件的系統測試，以溶葡萄球菌酶的熱穩定性為指標并以此進行突變體設計，獲得了一系列在tm值提高的突變體。其中篩選得到的有益突變體在60℃條件下的酶活損失減少5.8％-37.9％，tm值提高0.3-7.0℃。并且與野生型溶葡萄球菌酶進行活性比較相比，該突變體的酶活基本相當。為后續的存儲、運輸和擴大應用場景提供了便利。
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1.一種高熱穩定性的溶葡萄球菌酶突變體，其特征在于，其是在氨基酸序列為SEQ?IDNO.1所示的基礎上，存在以下一個或多個突變位點：K45Y、Y85F、N120G、M131L、S190A和S190W。
2.如權利要求1所述的溶葡萄球菌酶突變體，其特征在于，所述突變位點選自以下位點的組合，包括但不局限于以下突變體：K45Y/Y85F；K45Y/N120G；K45Y/S190A；Y85F/S190A；Y85F/S190W；Y85F/M131L；Y85F/N120G；N120G/S190A；K45Y/Y85F/N120G；Y85F/N120G/S190A；Y85F/M131L/S190A；Y85F/N120G/M131L。
3.如權利要求1或2所述的溶葡萄球菌酶突變體的編碼核酸。
4.含有如權利要求3所述的編碼核酸的表達載體，優選地所述表達載體是原核表達載體，包括但不局限于pET30a+。
5.含有如權利要求3所述的編碼核酸或如權利要求4所述的表達載體的重組菌株，具體地，其是真菌或細菌。
6.如權利要求5所述的重組菌株，其特征
7.如權利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述大腸桿菌大腸桿菌BL21（DE3）。
8.如權利要求1或2所述的溶葡萄球菌酶突變體，含有如權利要求3所述的編碼核酸，如權利要求4所述的表達載體，如權利要求5或6所述的重組菌株在制備抗葡萄球菌的制品中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述葡萄球菌包括但不限于表皮葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、盧格敦葡萄球菌、腐生葡萄球菌或金黃色葡萄球菌。
10.如權利要求8或9所述的應用，其特征在于，所述制品是食品、飼料、洗滌用品、藥品、化妝品和醫療器械。
...【技術特征摘要】
1.一種高熱穩定性的溶葡萄球菌酶突變體，其特征在于，其是在氨基酸序列為seq?idno.1所示的基礎上，存在以下一個或多個突變位點：k45y、y85f、n120g、m131l、s190a和s190w。
2.如權利要求1所述的溶葡萄球菌酶突變體，其特征在于，所述突變位點選自以下位點的組合，包括但不局限于以下突變體：k45y/y85f；k45y/n120g；k45y/s190a；y85f/s190a；y85f/s190w；y85f/m131l；y85f/n120g；n120g/s190a；k45y/y85f/n120g；y85f/n120g/s190a；y85f/m131l/s190a；y85f/n120g/m131l。
3.如權利要求1或2所述的溶葡萄球菌酶突變體的編碼核酸。
4.含有如權利要求3所述的編碼核酸的表達載體，優選地所述表達載體是原核表達載體，包括但不局限于pe...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張曉云，張曉立，張慧澤，朱銘薇，李華珍，章家泉，
申請(專利權)人：百葵銳深圳生物科技有限公司，
類型：發明
國別省市：
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