【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及遺傳多樣性分析，具體為一種識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法。
技術(shù)介紹
1、松材線蟲bursaphelenchus?xylophilusnickle起源于北美，屬于入侵物種，是松樹萎焉病的病原物。松材線蟲在北美對于本土樹種并沒有造成重大災(zāi)害，但是在亞洲和歐洲地區(qū)卻對松樹構(gòu)成重大威脅。據(jù)我國林草局統(tǒng)計，全國共有19個省(自治區(qū)、直轄市)超過600個縣級行政區(qū)發(fā)生松材線蟲病疫情，發(fā)生面積高達(dá)180.92萬hm2，病死松樹數(shù)量1947.03萬株，對我國林業(yè)造成不可磨滅的損失。
2、為了更進(jìn)一步了解松材線蟲，2011年公布了其全基因組測序結(jié)果。自首次公布基于短讀長測序的基因組組裝以來，高通量測序經(jīng)常被用于鑒定松材線蟲的致病性狀。松材線蟲在侵染過程中起到降解細(xì)胞壁功能的glycosidehydrolase45genefamily(gh45基因家族)內(nèi)切β-1，4-葡聚糖酶，是從真菌基因水平遺傳獲得的?？截悢?shù)變異(copy?numbervariation,cnv)是指在一個物種兩個個體之間的大于50bp的基因組序列范圍內(nèi)的拷貝數(shù)片段由于插入、缺失、重復(fù)、復(fù)雜多位點的變異等而引起本體表型的變化。多拷貝基因通常存在于重復(fù)區(qū)域內(nèi)，如重復(fù)片段(segment?duplications，sds)和串聯(lián)重復(fù)序列(tandemrepeat，trs)。trs是一種不穩(wěn)定的基因組元件，從頭到尾都是重復(fù)的，通常容易發(fā)生變異。由于其獨特的多態(tài)性，trs可以用于分析新的突變和連鎖遺傳，用作遺傳標(biāo)記。廣泛的研究也揭示了它們在調(diào)控微生物致
3、目前，松材線蟲致病相關(guān)多拷貝基因還沒有得到應(yīng)用，僅有對其他致病基因的研究，且不同地理來源的松材線蟲拷貝數(shù)變異沒有相關(guān)可靠的理論依據(jù)。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、(一)解決的技術(shù)問題
2、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供了一種識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，解決了目前松材線蟲致病相關(guān)多拷貝基因還沒有得到應(yīng)用，僅有對其他致病基因的研究，且不同地理來源的松材線蟲拷貝數(shù)變異沒有相關(guān)可靠理論依據(jù)的問題。
3、(二)技術(shù)方案
4、為實現(xiàn)以上目的，本專利技術(shù)通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：一種識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，先收集來自于不同地理位置的松材線蟲蟲株，提取其dna并進(jìn)行高通量測序；利用生物信息學(xué)軟件分析全基因組信息，得到各種存在cnv現(xiàn)象的串聯(lián)重復(fù)序列(tandem?repeat，tr)序列其位點，并對不同地理來源的松材線蟲蟲株致病相關(guān)纖維素酶多拷貝基因類型進(jìn)行鑒定。
5、優(yōu)選的，識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，步驟如下：
6、1)收集不同地理來源的松材線蟲病疫木，利用貝爾曼漏斗法分離疫木中的線蟲；收集線蟲液，并擴(kuò)大培養(yǎng)，將得到的線蟲液置4℃冰箱中保存?zhèn)溆茫?/p>
7、2)松材線蟲dna的提?。?/p>
8、3)將檢測合格的松材線蟲dna進(jìn)行高通量基因組測序；測序使用平臺為hiseq4000，測序方法為非鏈特異性、150bp雙末端測序，測序深度>40x，松材線蟲高通量測序；
9、4)利用生物信息學(xué)軟件分析高通量測序返回的原始數(shù)據(jù)，得到cnv數(shù)據(jù)，獲知松材線蟲體內(nèi)cnv分布情況，篩選出致病相關(guān)cnv序列；
10、5)通過設(shè)計特異性引物，識別cnv序列以及其中含有的tr序列，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證；
11、6)用tr序列特異性引物對不同地理來源的松材線蟲dna進(jìn)行pcr擴(kuò)增，觀察瓊脂糖凝膠的條帶數(shù)，并進(jìn)行分類。
12、優(yōu)選的，步驟1中，收集線蟲液于15ml離心管中，在顯微鏡下挑取線蟲液中的松材線蟲雌雄蟲30～50條，接入長滿灰葡萄孢的pda平板中，25℃培養(yǎng)至灰葡萄孢全部被吃完；用貝爾曼漏斗法將培養(yǎng)好的線蟲收集于15ml離心管中，3500rpm離心3min；去掉上清液，1:1體積加入0.1％硫酸鏈霉素，搖勻，靜置5～10min，離心，去上清；用無菌水反復(fù)洗滌3次，將得到的線蟲液置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
13、優(yōu)選的，步驟2中，提取方法為：取保存的200μl線蟲液于eppendorf管中，加入200μl線蟲裂解液，混勻；在65℃水浴中處理1h，每隔10min搖蕩1次；冷卻至室溫后，用等體積的酚抽提，4℃條件下，12000rpm離心20min，取上清液；用等體積酚：氯仿：異戊醇抽提，離心；用等體積氯仿：異戊醇，離心；在上清液中加入1/10體積的3mmol/l的乙酸鈉和2倍體積的無水乙醇，在-80℃條件下冷凍20min；12000rpm離心20min，沉淀用70％的乙醇洗滌兩次，室溫晾干，沉淀氣干1h；加入100μlte重新懸浮沉淀，取其中5μl用無菌水稀釋200倍，用紫外光分光光度計測定dna濃度，-20℃?zhèn)溆谩?/p>
14、優(yōu)選的，步驟5-6中，測序前，首先用nanodrop2000測定1.2中提取的dna濃度，再通過1％瓊脂糖凝膠電泳來檢測dna質(zhì)量。
15、優(yōu)選的，步驟5-6中，在259個供試蟲株中，cnv主要分為三類，分別為單拷貝、二拷貝和三拷貝，其中二拷貝占比最大，其次是單拷貝，最少的是三拷貝。
16、(三)有益效果
17、本專利技術(shù)的目的是提供一種識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，通過illumina高通量基因組測序，用生信軟件分析多拷貝序列特征，從分子的角度探究不同種群松材線蟲拷貝數(shù)變異情況，為該病害防控策略的制訂提供可靠的理論依據(jù)。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點】
1.一種識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，其特征在于，先收集來自于不同地理位置的松材線蟲蟲株，提取其DNA并進(jìn)行高通量測序；利用生物信息學(xué)軟件分析全基因組信息，得到各種存在CNV現(xiàn)象的串聯(lián)重復(fù)序列(tandem?repeat，TR)序列其位點，并對不同地理來源的松材線蟲蟲株致病相關(guān)纖維素酶多拷貝基因類型進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，其特征在于，步驟如下：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，其特征在于，步驟1中，收集線蟲液于15mL離心管中，在顯微鏡下挑取線蟲液中的松材線蟲雌雄蟲30～50條，接入長滿灰葡萄孢的PDA平板中，25℃培養(yǎng)至灰葡萄孢全部被吃完；用貝爾曼漏斗法將培養(yǎng)好的線蟲收集于15mL離心管中，3500rpm離心3min；去掉上清液，1:1體積加入0.1％硫酸鏈霉素，搖勻，靜置5～10min，離心，去上清；用無菌水反復(fù)洗滌3次，將得到的線蟲液置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，其特征在于，步驟2中，提取方法為：...
【技術(shù)特征摘要】
1.一種識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，其特征在于，先收集來自于不同地理位置的松材線蟲蟲株，提取其dna并進(jìn)行高通量測序；利用生物信息學(xué)軟件分析全基因組信息，得到各種存在cnv現(xiàn)象的串聯(lián)重復(fù)序列(tandem?repeat，tr)序列其位點，并對不同地理來源的松材線蟲蟲株致病相關(guān)纖維素酶多拷貝基因類型進(jìn)行鑒定。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，其特征在于，步驟如下：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，其特征在于，步驟1中，收集線蟲液于15ml離心管中，在顯微鏡下挑取線蟲液中的松材線蟲雌雄蟲30～50條，接入長滿灰葡萄孢的pda平板中，25℃培養(yǎng)至灰葡萄孢全部被吃完；用貝爾曼漏斗法將培養(yǎng)好的線蟲收集于15ml離心管中，3500rpm離心3min；去掉上清液，1:1體積加入0.1％硫酸鏈霉素，搖勻，靜置5～10min，離心，去上清；用無菌水反復(fù)洗滌3次，將得到的線蟲液置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的識別松材線蟲纖維素酶多拷貝基因的方法，其特征在于，步驟2中，提取方法為：取保存的20...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：丁曉磊，趙瑞文，張悅，景婷婷，廖常杰，葉建仁，林司曦，喬嫦霞，
申請(專利權(quán))人：南京林業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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