【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因工程，特別是涉及一種通過敲除 da2d基因或 da2d基因和 hpb基因在降低赤蘚糖醇發(fā)酵產(chǎn)泡沫性能中的應用。
技術(shù)介紹
1、解脂耶氏酵母（ yarrowia?lipolytica）能夠利用微生物發(fā)酵生成赤蘚糖醇，該方法在發(fā)酵產(chǎn)量、菌株安全性等方面獨具優(yōu)勢。但是目前國內(nèi)外使用的解脂耶氏酵母菌株在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生大量的泡沫，發(fā)酵產(chǎn)生泡沫不但會降低發(fā)酵罐的有效利用率，而且容易溢罐導致染菌的現(xiàn)象發(fā)生，給企業(yè)帶來損失。為了減少泡沫的形成，就需要向發(fā)酵液中添加消泡劑，但使用消泡劑不但會增加成本，增加產(chǎn)物的分離提取難度，還會抑制細胞的生長。目前關于赤蘚糖醇泡沫形成原因不明，對于抑制泡沫產(chǎn)生的相關基因及相關功能菌種的研究報道較少。因此，研究開發(fā)無泡或者低泡發(fā)酵的解脂耶氏酵母新菌株對于提高赤蘚糖醇的發(fā)酵效率與降低發(fā)酵成本具有重要意義。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、為了解決上述問題，本專利技術(shù)提供了一種通過敲除 da2d基因或 da2d基因和 hpb基因在降低赤蘚糖醇發(fā)酵產(chǎn)泡沫性能中的應用。本專利技術(shù)發(fā)現(xiàn) da2d基因和 hpb基因與泡沫產(chǎn)生有關系，敲除 da2d基因以及共
2、為了實現(xiàn)上述目的，本專利技術(shù)提供如下技術(shù)方案：
3、本專利技術(shù)提供了敲除菌種中的 da2d基因或敲除菌種中的 da2d基因和 hpb基因在降低菌種發(fā)酵產(chǎn)泡沫性能中的應用，所述 da2d基因編碼的蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，所述 hpb基因編碼的蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；所述菌種包括解脂耶氏酵母。
4、優(yōu)選的，所述 da2d基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示，所述 hpb基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
5、優(yōu)選的，敲除所述菌種中 da2d基因的敲除組件為第一敲除組件；敲除所述菌種中 da2d基因和 hpb基因的敲除組件由所述第一敲除組件和第二敲除組件組成；所述第一敲除組件的核苷酸序列如seq?id?no.14所示，所述第二敲除組件的核苷酸序列如seq?id?no.24所示。
6、優(yōu)選的，構(gòu)建所述第一敲除組件的第一試劑盒包括第一引物組，構(gòu)建所述第二敲除組件的第二試劑盒包括第二引物組；所述第一引物組包括第一引物對、第二引物對和第三引物對，所述第一引物對的核苷酸序列如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示，所述第二引物對的核苷酸序列如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示，所述第三引物對的核苷酸序列如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示；所述第二引物組包括第四引物對、第五引物對和第六引物對，所述第四引物對的核苷酸序列如seq?id?no.15和seq?id?no.16所示，所述第五引物對的核苷酸序列如seq?id?no.17和seq?id?no.18所示，所述第六引物對的核苷酸序列如seq?id?no.19和seq?id?no.20所示。
7、優(yōu)選的，所述第一試劑盒還包括解脂耶氏酵母和pgapzαa載體；所述第二試劑盒還包括解脂耶氏酵母和pbc-hygro載體。
8、優(yōu)選的，所述第一敲除組件的構(gòu)建方法包括以下步驟：
9、以解脂耶氏酵母的基因組為模版，利用第一引物對進行pcr擴增，得到 da2d基因的上游片段；
10、以解脂耶氏酵母的基因組為模版，利用第二引物對進行pcr擴增，得到 da2d基因的下游片段；
11、以pgapzαa載體為模板，利用第三引物對進行pcr擴增，得到 zeo抗性片段；
12、利用重疊延伸pcr方法，將所述 da2d基因的上游片段、 da2d基因的下游片段和 zeo抗性片段連接，得到第一敲除組件。
13、優(yōu)選的，所述第二敲除組件的構(gòu)建方法包括以下步驟：
14、以解脂耶氏酵母的基因組為模版，利用第四引物對進行pcr擴增，得到 hpb基因的上游片段；
15、以解脂耶氏酵母的基因組為模版，利用第五引物對進行pcr擴增，得到 hpb基因的下游片段；
16、以pbc-hygro載體為模板，利用第六引物對進行pcr擴增，得到 hyg抗性片段；
17、利用重疊延伸pcr方法，將所述 hpb基因的上游片段、 hpb基因的下游片段和 hyg抗性片段連接，得到第二敲除組件。
18、優(yōu)選的，敲除所述菌種中 da2d基因的方法包括以下步驟：
19、將所述第一敲除組件轉(zhuǎn)入解脂耶氏酵母中，得到第一轉(zhuǎn)化子；
20、將所述第一轉(zhuǎn)化子涂布到含有博來霉素的平板上，培養(yǎng)得到的菌落為敲除 da2d基因的解脂耶氏酵母。
21、優(yōu)選的，敲除所述菌種中 da2d基因和 hpb基因的方法包括以下步驟：
22、將所述第二敲除組件轉(zhuǎn)入所述敲除 da2d基因的解脂耶氏酵母中，得到第二轉(zhuǎn)化子；
23、將所述第二轉(zhuǎn)化子涂布到含有潮霉素的平板上，培養(yǎng)得到的菌落為敲除 da2d基因和 hpb基因的解脂耶氏酵母。
24、有益效本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護點】
1.敲除菌種中的Da2d基因或敲除菌種中的Da2d基因和hpB基因在降低菌種發(fā)酵產(chǎn)泡沫性能中的應用，所述Da2d基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述hpB基因編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；所述菌種包括解脂耶氏酵母（Yarrowia?lipolytica）。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述Da2d基因的核苷酸序列如SEQ?IDNO.3所示，所述hpB基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，敲除所述菌種中Da2d基因的敲除組件為第一敲除組件；敲除所述菌種中Da2d基因和hpB基因的敲除組件由所述第一敲除組件和第二敲除組件組成；所述第一敲除組件的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.14所示，所述第二敲除組件的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.24所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，構(gòu)建所述第一敲除組件的第一試劑盒包括第一引物組，構(gòu)建所述第二敲除組件的第二試劑盒包括第二引物組；所述第一引物組包括第一引物對、第二引物對和第三引物對，所述
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述第一試劑盒還包括解脂耶氏酵母和pGAPZαA載體；所述第二試劑盒還包括解脂耶氏酵母和pBC-hygro載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述第一敲除組件的構(gòu)建方法包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于，所述第二敲除組件的構(gòu)建方法包括以下步驟：
8.根據(jù)權(quán)利要求3~7任一項所述的應用，其特征在于，敲除所述菌種中Da2d基因的方法包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應用，其特征在于，敲除所述菌種中Da2d基因和hpB基因的方法包括以下步驟：
...【技術(shù)特征摘要】
1.敲除菌種中的da2d基因或敲除菌種中的da2d基因和hpb基因在降低菌種發(fā)酵產(chǎn)泡沫性能中的應用，所述da2d基因編碼的蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，所述hpb基因編碼的蛋白的氨基酸序列如seq?id?no.2所示；所述菌種包括解脂耶氏酵母（yarrowia?lipolytica）。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，所述da2d基因的核苷酸序列如seq?idno.3所示，所述hpb基因的核苷酸序列如seq?id?no.4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于，敲除所述菌種中da2d基因的敲除組件為第一敲除組件；敲除所述菌種中da2d基因和hpb基因的敲除組件由所述第一敲除組件和第二敲除組件組成；所述第一敲除組件的核苷酸序列如seq?id?no.14所示，所述第二敲除組件的核苷酸序列如seq?id?no.24所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應用，其特征在于，構(gòu)建所述第一敲除組件的第一試劑盒包括第一引物組，構(gòu)建所述第二敲除組件的第二試劑盒包括第二引物組；所述第一引物組包括第一引物對、第二引物對和第三引物對，所述第一引物對的核苷酸序列如seq?id?no.5和seq?id?no....
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王瑞明，王松江，耿曉琦，郭傳莊，汪俊卿，李丕武，王建彬，
申請(專利權(quán))人：東曉生物科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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