【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及矽肺模型建立領域，尤其涉及呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法。
技術介紹
1、職業性矽肺(以下簡稱“矽肺”)是一種古老而可能致命的職業性塵肺病，其目前尚無有效的治療方法，且發病機制尚不明確。動物模型的建立對矽肺發病機制的研究非常重要，可為矽肺后續的有效治療奠定理論基礎。
2、現有的研究多采用大鼠和小鼠建立矽肺模型，考慮到生存率、造模成功率和飼養成本等因素，大鼠在矽肺造模中應用最多。現有的造模方法中，動靜式口鼻吸入染塵法的染塵裝置耗資較大，染塵時間長，染塵劑量難以控制，染塵過程中動物感染率和死亡率較高；肺外染塵法雖然操作簡單，但與工人在實際工作場所中接觸粉塵的情況不同；非暴露式鼻腔內滴注法雖操作簡單，但滴注劑量不易掌握，滴注劑量較大時易造成大鼠死亡。因此，上述方法均不適合作為矽肺臨床研究造模使用。
3、氣管內滴注造模法，操作簡便，染塵劑量易控制，成功率高，是目前經典的矽肺造模方法；其可分為暴露式氣管內注入法和非暴露式氣管內注入法。暴露式氣管內注入法操作復雜，需進行手術暴露氣管，容易造成大鼠出血、感染甚至死亡等。非暴露式氣管內注入法，因其操作時間短，動物不易出現感染和死亡等而被廣泛應用。
4、國內外研究多采用非暴露式氣管內注入法建立大鼠矽肺模型。由于大鼠呼吸頻率快、聲門狹窄等問題，近年來不少研究對非暴露式氣管內注入法進行了改良。如氣管盲插法，但其成功率低，且經常反復插管易引起大鼠喉頭水腫和氣道損傷甚至死亡。
5、既往傳統的氣管內滴注法在建立大鼠矽肺模型的過程
技術實現思路
1、本專利技術要解決的技術問題是為了克服現有技術中的大鼠矽肺模型建立的操作復雜且成功率低的缺陷，提供呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法。
2、本專利技術是通過下述技術方案來解決上述技術問題：
3、本專利技術提供呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，所述建立方法包括如下操作步驟：
4、步驟一、預處理，對大鼠進行麻醉及固定；
5、步驟二、氣管插管，采用光源動物小喉鏡暴露大鼠聲門，經聲門將氣管套管針輕插至氣道；
6、步驟三、氣管滴注，通過氣管套管針分別將1.0ml0.9％氯化鈉溶液和質量濃度為50g/l的二氧化硅混懸液分4次緩慢滴注入2組大鼠氣管內；
7、步驟四、呼吸機聯合，于每次氣管滴注后均將氣管套管針連接呼吸機輔助通氣，當潮氣量達2.0ml時進行下次滴注，最后1次滴注后連接呼吸機，當潮氣量約為2.0ml后拔出氣管插管，撤離呼吸機后，將大鼠放入籠內待蘇醒；
8、步驟五、觀察記錄，獲取實驗開始前、造模后的第1、2、3、4周記錄2組大鼠的體質量；
9、步驟六、處理分析，獲取兩組大鼠的肺組織，采用蘇木精-伊紅染色及masson染色分析兩組大鼠肺組織的病理學改變情況。
10、在本技術方案中，在每次氣管滴注后連接小動物呼吸機輔助大鼠通氣，有利于矽塵有效擴散到大鼠肺泡，既保證了造模的成功率，也使大鼠呼吸通暢，從而保障了其存活率，且小動物喉鏡在直視下將套管針通過聲門插入氣管中，再將套管針連接帶有0.1ml的0.9％氯化鈉溶液的輸液管，以判斷套管針是否在氣管內，通過大鼠的呼吸節律運動，觀察輸液管中少量水柱波動，從而判斷是否成功插入氣管，且輸液管中少量的0.9％氯化鈉溶液不會被大鼠吸入肺中，并于每次氣管滴注后連接小動物呼吸機輔助大鼠通氣，有利于矽塵有效擴散到大鼠肺泡，既保證了造模的成功率，也使大鼠呼吸通暢，從而保障了其存活率。
11、較佳地，所述步驟一中，選擇偶數個大鼠，并將大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組和對照組大鼠數量相同。
12、較佳地，所述步驟一中預處理的具體操作步驟為；
13、s1、麻醉處理，大鼠按45mg/kg體質量腹腔注射質量分數為3.0％的戊巴比妥鈉溶液麻醉，麻醉深度以夾捏大鼠的皮膚或腳趾無收縮反應為準；
14、s2、固定處理，采用橡皮筋將大鼠的切牙、四肢固定于大鼠固定臺，使其頭頸部和實驗員的視線保持于一條直線上。
15、較佳地，所述步驟二中，氣管套管針的進針長度約為套管針的3/4后拔出針芯。
16、較佳地，所述步驟二中通過氣管套管針將含有0.1ml0.9％氯化鈉溶液的輸液管連接插管，若輸液管內液體隨著大鼠呼吸來回運動，則提示插管成功。
17、較佳地，所述步驟三中二氧化硅混懸液的配制是取50mg二氧化硅顆粒于瑪瑙研缽充分研磨，使得粒徑<5.0μm的二氧化硅顆粒達到90.0％以上，經180℃烘干6h后，加入1.0ml的0.9％氯化鈉溶液混勻。
18、較佳地，所述s2步驟中，將大鼠固定后，對大鼠自下頜至胸骨上方頸部區域剪毛，并用碘酒、酒精消毒。
19、較佳地，所述步驟六中，蘇木精-伊紅染色即he染色法，蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。
20、較佳地，所述步驟六中masson染色又稱馬松染色，其與陰離子染料分子的大小和組織的滲透有關，分子的大小由分子量來體現，小分子量易穿透結構致密、滲透性低的組織，而大分子量則只能進入結構疏松的、滲透性高的組織，然而淡綠或苯胺藍的分子量都很大，因此masson染色后肌纖維呈紅色，膠原纖維呈綠色或藍色，主要用于區分膠原纖維和肌纖維。
21、較佳地，所述大鼠的選取標準為，無特定病原體級健康雄性sd大鼠，6周齡，體質量(200±20)g，自由攝食和飲水，適應性飼養2周后，大鼠隨機分為實驗組和對照組。
22、在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本專利技術各較佳實例。
23、本專利技術的積極進步效果在于：
24、本專利技術在每次氣管滴注后連接小動物呼吸機輔助大鼠通氣，有利于矽塵有效擴散到大鼠肺泡，既保證了造模的成功率，也使大鼠呼吸通暢，從而保障了其存活率，且小動物喉鏡在直視下將套管針通過聲門插入氣管中，再將套管針連接帶有0.1ml的0.9％氯化鈉溶液的輸液管，以判斷套管針是否在氣管內，通過大鼠的呼吸節律運動，觀察輸液管中少量水柱波動，從而判斷是否成功插入氣管，且輸液管中少量的0.9％氯化鈉溶液不會被大鼠吸入肺中，并于每次氣管滴注后連接小動物呼吸機輔助大鼠通氣，有利于矽塵有效擴散到大鼠肺泡，既保證了造模的成功率，也使大鼠呼吸通暢，從而保障了其存活率。
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1.呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述建立方法包括如下操作步驟：
2.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟一中，選擇偶數個大鼠，并將大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組和對照組大鼠數量相同。
3.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟一中預處理的具體操作步驟為；
4.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟二中，氣管套管針的進針長度約為套管針的3/4后拔出針芯。
5.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟二中通過氣管套管針將含有0.1mL0.9％氯化鈉溶液的輸液管連接插管，若輸液管內液體隨著大鼠呼吸來回運動，則提示插管成功。
6.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟三中二氧化硅混懸液的配制是取50mg二氧化硅顆粒于瑪瑙研缽充分研磨，使得粒徑&l
7.如權利要求3所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述S2步驟中，將大鼠固定后，對大鼠自下頜至胸骨上方頸部區域剪毛，并用碘酒、酒精消毒。
8.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟六中，蘇木精-伊紅染色即HE染色法，蘇木精染液為堿性，主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色；伊紅為酸性染料，主要使細胞質和細胞外基質中的成分著紅色。
9.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟六中Masson染色又稱馬松染色，其與陰離子染料分子的大小和組織的滲透有關，分子的大小由分子量來體現，小分子量易穿透結構致密、滲透性低的組織，而大分子量則只能進入結構疏松的、滲透性高的組織，然而淡綠或苯胺藍的分子量都很大，因此Masson染色后肌纖維呈紅色，膠原纖維呈綠色或藍色，主要用于區分膠原纖維和肌纖維。
10.如權利要求2所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述大鼠的選取標準為，無特定病原體級健康雄性SD大鼠，6周齡，體質量(200±20)g，自由攝食和飲水，適應性飼養2周后，大鼠隨機分為實驗組和對照組。
...【技術特征摘要】
1.呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述建立方法包括如下操作步驟：
2.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟一中，選擇偶數個大鼠，并將大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組和對照組大鼠數量相同。
3.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟一中預處理的具體操作步驟為；
4.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟二中，氣管套管針的進針長度約為套管針的3/4后拔出針芯。
5.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟二中通過氣管套管針將含有0.1ml0.9％氯化鈉溶液的輸液管連接插管，若輸液管內液體隨著大鼠呼吸來回運動，則提示插管成功。
6.如權利要求1所述的呼吸機聯合非暴露式氣管滴注大鼠矽肺模型的建立方法，其特征在于：所述步驟三中二氧化硅混懸液的配制是取50mg二氧化硅顆粒于瑪瑙研缽充分研磨，使得粒徑<5.0μm的二氧化硅顆粒達到90.0％以上，經180℃烘干6h后，加入1.0ml的0.9％氯化鈉溶液混勻。
【專利技術屬性】
技術研發人員：尹琴，徐波，李鳳琴，王沁濡，甘洪玉，
申請(專利權)人：湖北省中西醫結合醫院湖北省職業病醫院，
類型：發明
國別省市：
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