【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物工程，具體涉及一種生產紐莫康定b0的基因工程菌及其構建與應用。
技術介紹
1、紐莫康定(pneumocandins)屬于棘白霉素類抗生素，該類抗生素可以非競爭性抑制參與真菌細胞壁合成的β-(1,3)-d-葡聚糖合酶，因其作用機制使該類抗生素具有毒副作用小的優點。目前，上市的棘白霉素類抗生素有卡泊芬凈、阿尼芬凈和米卡芬凈，主要用于深部真菌感染的治療。
2、紐莫康定是由絲狀真菌g.lozoyensis產生的一系列結構相似的化合物，其差異在于環上第1個氨基酸殘基，pb0為4r,5r-dihydroxy-l-orn，而pb5為5r-dihydroxy-l-orn。因結構相似，分離純化較為困難。
技術實現思路
1、為解決現有技術中難以降低雜質例如pb5，且pb5和pb0的分離較為困難，生產上需要使用正向色譜柱，分離成本較高的缺陷。本專利技術提供了一種生產紐莫康定b0的基因工程菌及其構建與應用。
2、本專利技術通過對pb0的產生菌株g.lozoyensis?atcc?74030進行基因改造，降低了雜質pb5的產生，降低了pb5/pb0的比值。
3、本專利技術對菌株glarea?lozoyensis?atcc?74030中pneumocandins的生物合成途徑進行分析，通過過表達gloo或其同源蛋白來降低pb5的產生。構建含有g418抗性基因的質粒pagg，該質粒在pag1-h3基礎上進行構建。在質粒pagg的基礎上利用分子克隆方法分別構建
4、本專利技術第一方面提供一種基因工程菌，所述基因工程菌過表達細胞色素p450酶基因，其中所述基因工程菌的出發菌株為絲狀真菌glarea?lozoyensis。
5、在某些實施方案中，所述細胞色素p450酶基因存在于質粒中，或通過同源重組隨機整合在所述絲狀真菌的基因組上。
6、在某些實施方案中，所述細胞色素p450酶基因選自編碼以下蛋白的基因中的一個或多個：gloo、cep450-2和ecdh。
7、在某些實施方案中，
8、所述gloo的氨基酸序列如seq?id?no:16所示，
9、所述cep450-2的氨基酸序列如seq?id?no:18所示，
10、所述ecdh的氨基酸序列如seq?id?no:20所示。
11、在某些實施方案中，所述出發菌株為絲狀真菌glarea?lozoyensis?atcc?74030。
12、在某些實施方案中，所述細胞色素p450酶基因在一基因表達盒中，其上游和下游分別具有啟動子和終止子；較佳地，所述啟動子和終止子分別為trpc啟動子和trpc終止子。
13、在某些實施方案中，所述基因表達盒在一表達載體中，所述的表達載體的骨架優選質粒pagg。
14、本專利技術第二方面提供一種如本專利技術第一方面所述的基因工程菌的制備方法，所述制備方法包括下列步驟：
15、1)構建含有所述細胞色素p450酶基因的表達載體；
16、2)以所述絲狀真菌glarea?lozoyensis為宿主菌，轉化步驟1)得到的表達載體，獲得過表達細胞色素p450酶的基因工程菌。
17、優選地，所述1)中，所述表達載體的構建方法為：
18、a、構建含gpd啟動子片段、gpd終止子片段的基因表達盒的表達載體；
19、b、將所述細胞色素p450酶基因插入所述基因表達盒即得。
20、在某些實施方案中，所述的轉化利用amt技術或電轉導，例如為amt技術。
21、本專利技術第三方面提供如本專利技術第一方面所述的基因工程菌在制備紐莫康定b0上的用途。
22、本專利技術第四方面提供一種制備紐莫康定b0的方法，所述方法包括使用發酵培養基培養如本專利技術第一方面所述的基因工程菌，使之發酵并生產紐莫康定b0。
23、所述方法滿足以下一種或多種條件：
24、(1)發酵培養基的配方包括：甘露醇、棉籽餅粉、黃豆餅粉、k2hpo4、caco3和l-pro；
25、(2)所述發酵培養基的ph值為6～7例如為6.5；
26、(3)所述培養的溫度為20-30℃例如25℃；
27、(4)所述培養為振蕩培養，優選地，所述振蕩的速度為200-300rpm例如220rpm；
28、(5)所述培養的時間為5～15天例如10天。
29、在某些實施方案中，所述發酵培養基包括甘露醇60-140g/l例如100g/l、棉籽餅粉3-8g/l例如5g/l、黃豆餅粉5-15g/l例如10g/l、k2hpo4?3-6g/l例如4g/l、caco3?0.5-2g/l例如1g/l、l-pro?10-30g/l例如20g/l。
30、在符合本領域常識的基礎上，上述各優選條件，可任意組合，即得本專利技術各較佳實例。
31、本專利技術所用試劑和原料均市售可得。
32、本專利技術的積極進步效果在于：
33、本專利技術通過在出發菌株中表達細胞色素p450酶基因，可降低發酵產物中的pb5/pb0比例，在降低pb5的含量的同時提高了pb0的含量。pb5/pb0的比值可由2.9％至少下降至1％。在優選實施方案中，pb5/pb0的比值從2.9％±0.1％降低至0.3％±0.1％。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌過表達細胞色素P450酶基因，其中所述基因工程菌的出發菌株為絲狀真菌Glarea?lozoyensis。
2.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述細胞色素P450酶基因存在于質粒中，或通過同源重組隨機整合在所述絲狀真菌的基因組上。
3.如權利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述細胞色素P450酶基因選自編碼以下蛋白的基因中的一個或多個：GLoO、CEP450-2和ECDH；優選地，
4.如權利要求1-3中任一項所述的基因工程菌，其特征在于，所述出發菌株為絲狀真菌Glarea?lozoyensis?ATCC?74030。
5.如權利要求1-4中任一項所述的基因工程菌，其特征在于，所述細胞色素P450酶基因在一基因表達盒中，其上游和下游分別具有啟動子和終止子；較佳地，所述啟動子和終止子分別為trpC啟動子和trpC終止子。
6.如權利要求1-5中任一項所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因表達盒在一表達載體中，所述的表達載體的骨架優選質粒pAgG。
8.如權利要求7所述的基因工程菌的制備方法，其特征在于，所述的轉化利用AMT技術或電轉導，例如為AMT技術。
9.如權利要求1-6中任一項所述的基因工程菌在制備紐莫康定B0上的用途。
10.一種制備紐莫康定B0的方法，其特征在于，所述方法包括使用發酵培養基培養如權利要求1-6中任一項所述的基因工程菌，使之發酵并生產紐莫康定B0。
11.如權利要求10所述的方法，其特征在于，其滿足以下一種或多種條件：
...【技術特征摘要】
1.一種基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌過表達細胞色素p450酶基因，其中所述基因工程菌的出發菌株為絲狀真菌glarea?lozoyensis。
2.如權利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述細胞色素p450酶基因存在于質粒中，或通過同源重組隨機整合在所述絲狀真菌的基因組上。
3.如權利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述細胞色素p450酶基因選自編碼以下蛋白的基因中的一個或多個：gloo、cep450-2和ecdh；優選地，
4.如權利要求1-3中任一項所述的基因工程菌，其特征在于，所述出發菌株為絲狀真菌glarea?lozoyensis?atcc?74030。
5.如權利要求1-4中任一項所述的基因工程菌，其特征在于，所述細胞色素p450酶基因在一基因表達盒中，其上游和下游分別具有啟動子和終止...
【專利技術屬性】
技術研發人員：陳少欣，衛騰云，楊松柏，
申請(專利權)人：上海醫藥工業研究院有限公司，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。