【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于醫藥領域，具體地說，涉及一種lrrk2.p.n1437d點突變小鼠模型的構建方法及應用。
技術介紹
1、帕金森病是一種以靜止性震顫、運動遲緩、僵直和姿勢反射損害為臨床特征，病理上表現為黑質的多巴胺能神經元丟失和細胞內路易小體沉積的一種進行性的神經退行性疾病。lrrk2突變作為最常見的風險性因素，在西方國家占到了10-15％的家族性帕金森病和1-2％的散發性帕金森病的發病。其中，最常見的7個lrrk2致病突變有p.g2019s,p.r1441c,p.r1441g,p.r1441h,p.y1699c,p.i2020t,and?p.n1437h，它們會引起lrrk2蛋白gtpase和激酶結構域的功能異常。
2、盡管基于以上常見突變已有多種lrrk2的knock?in(ki)鼠或轉基因鼠，但是現有的g2019s和r1441c的lrrk2點突變ki小鼠直至動物生命終點也無法引起小鼠pd相關行為學和病理學的變化，而現有的lrrk2突變模型動物中只有g2019s、r1441c和r1441g突變體lrrk2的過表達或是借助外源壓力的誘導才能模擬出pd相關的行為改變和病理表型。但過表達或是藥物誘導的條件中取得的實驗結果與lrrk2突變攜帶病人的真實情況終究有著很大的區別，依據這些結果所研發的藥物可能會給研發者予以錯誤的提示，因此研發一種更貼近于病人真實情況的lrrk2點突變小鼠便顯得尤為重要。
3、現有文獻報道：新的lrrk2致病突變n1437d(c.4309a>g；nm_98578)，該突變在進化上極
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種lrrk2.p.n1437d點突變小鼠模型的構建方法。
2、本專利技術的另一個目的是提供一種所述方法構建的lrrk2.p.n1437d點突變小鼠模型在制備治療帕金森病中的應用。
3、為了實現上述目的，本專利技術采用的技術方案如下：
4、本專利技術的第一方面，提供了一種lrrk2.p.n1437d點突變小鼠模型的構建方法，包括以下步驟：
5、第一步，確定待突變的n1437d(c.4309a)位點位于lrrk2基因的第30號外顯子處，根據n1437d(c.4309a)位點序列，利用cas9/grna設計guide?rna(簡稱為grna)以及同源修復模板donor?dna序列；
6、構建針對lrrk2基因第30號外顯子的特異性靶點guide?rna，并在體外轉錄為guide?rna；
7、所述第一步中體外轉錄為guide?rna的序列如seq?id?no.1所示：
8、caccttgatattgaagagcc?agg(seq?id?no.1)
9、所述第一步中同源修復模板donor?dna序列如seq?id?no.2所示：
10、ctatgatctcagcaaggggcaggcagaggtggacgccatgaagccttggctcttc?gatatcaaggtgatttcttctgatcacgtgggactagagtgtgatcattgctcac(seq?id?no.2)，其中，donor?dna序列第46位處的t為突變后的堿基，donor?dna序列第56位處的g是為防止grna二次切割所做的同義突變。
11、第二步，將第一步獲得的guide?rna、donor?dna和cas9?mrna混合組成注射液，通過受精卵顯微注射的方式將注射液遞送至c57bl/6j小鼠的受精卵細胞核中；
12、第三步，將第二步獲得的存活的受精卵移植至代孕鼠生殖系統，出生的小鼠經過引物為n1437d-p1-f(seq?id?no.3)和n1437d-p2-r(seq?id?no.4)的pcr擴增后，再用n1437d-p1-f(seq?id?no.3)作為測序引物對擴增出的片段進行dna測序，其中測序陽性的小鼠即為基因編輯攜帶lrrk2.p.n1437d突變的f0代陽性小鼠(lrrk2.p.n1437d點突變陽性f0子代)；
13、所述第三步中n1437d-p1-f的pcr引物兼測序用引物序列如seq?id?no.3所示：
14、atacggggcaaaaggagaaaggac(seq?id?no.3)
15、所述第三步中n1437d-p2-r的pcr引物的序列如seq?id?no.4所示：
16、tggggcaacagacagcaatcac(seq?id?no.4)
17、第四步，將第三步中獲得經過基因編輯攜帶lrrk2.p.n1437d突變的f0代陽性小鼠與c57bl/6j野生型小鼠雜交，再通過引物為n1437d-p1-f(seq?id?no.3)和n1437d-p2-r(seq?id?no.4)的pcr擴增后，再用n1437d-p1-f(seq?id?no.3)作為測序引物對擴增出的片段進行dna測序，被鑒定為測序陽性的f1代(即穩定遺傳攜帶lrrk2.p.n1437d點突變的f1代)后代即可穩定遺傳；
18、第五步，通過將第四步獲得的穩定遺傳攜帶的f1代lrrk2.p.n1437d突變雜合子小鼠(het)或是穩定遺傳攜帶的f1代lrrk2.p.n1437d突變小鼠與c57bl/6j野生型小鼠雜交后獲得的攜帶lrrk2.p.n1437d突變的雜合子代自交，經過n1437d-p1-f(seq?id?no.3)和n1437d-p2-r(seq?id?no.4)的pcr擴增后，再用n1437d-p1-f(seq?id?no.3)作為測序引物對擴增出的片段進行dna測序，即可獲得研究和實驗所使用的同窩的lrrk2.p.n1437d的lrrk2野生型小鼠(wt)、lrrk2.p.n1437d突變雜合子小鼠(het)和lrrk2.p.n1437d突變純合子小鼠(homo)。
19、本專利技術的第二方面，提供了一種所述方法構建的lrrk2.p.n1437d點突變小鼠模型在制備治療帕金森病中的應用。
20、本專利技術的第三方面，提供了一種構建lrrk2.p.n1437d點突變小鼠模型的試劑盒，含有guide?rna、donor?dna、cas9?mrna、引物n1437d-p1-f、引物n1437d-p2-r；所述guiderna的序列為seq?id?no.1，所述donor?dna的序列為seq?id?no.2，所述引物n1437d-p1-f的序列為seq?id?no.3，所述引物n1437d-p2-r的序列為seq?id?no.4。
21、由于采用上述技術方案，本專利技術具有以下優點和有益效果：
22、本專利技術利用crisp本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種LRRK2.p.N1437D點突變小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.一種權利要求1所述方法構建的LRRK2.p.N1437D點突變小鼠模型在制備治療帕金森病中的應用。
3.一種構建LRRK2.p.N1437D點突變小鼠模型的試劑盒，含有Guide?RNA、Donor?DNA、Cas9?mRNA、引物N1437D-P1-F、引物N1437D-P2-R；所述Guide?RNA的序列為SEQ?ID?NO.1，所述Donor?DNA的序列為SEQ?ID?NO.2，所述引物N1437D-P1-F的序列為SEQ?ID?NO.3，所述引物N1437D-P2-R的序列為SEQ?ID?NO.4。
【技術特征摘要】
1.一種lrrk2.p.n1437d點突變小鼠模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.一種權利要求1所述方法構建的lrrk2.p.n1437d點突變小鼠模型在制備治療帕金森病中的應用。
3.一種構建lrrk2.p.n1437d點突變小鼠模型的試劑盒，含有guide?rna、donor?...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王堅，孫一忞，干林華，鄔劍軍，郁文博，劉豐韜，趙玨，唐一麟，陳晨，
申請(專利權)人：復旦大學附屬華山醫院，
類型：發明
國別省市：
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