【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及食品安全以及分析化學的，具體為雙模態多粘菌素耐藥基因mcr-1檢測平臺。
技術介紹
1、致病菌一直是導致人類疾病的主要病因之一，對全球的公共衛生造成了巨大威脅。這些致病菌有很大一部分是以食物為載體而導致疾病，也稱為食源性致病菌。食源性致病菌所引發的食源性疾病不僅對人體健康造成了嚴重危害，并且也對全球經濟造成了巨大沖擊。更為嚴重的是，由抗生素的濫用而導致的耐藥性增強進一步加劇了食源性致病菌對于公共衛生的威脅。其中在碳青霉烯耐藥腸桿菌科中發現的質粒介導的多粘菌素耐藥基因(mcr-1、2、3、4、5、6和7)，特別是mcr-1，作為危害極大的幾種耐藥基因之一，主要存在于沙門氏菌及大腸桿菌等常見食源性致病菌體內，每年造成數十萬人死亡。基于此，開發出一種能夠靈敏快速且準確地檢測出食品樣品中的多粘菌素耐藥基因mcr-1的方法對于防止食源性致病菌的傳播、維護人們身體健康具有重大意義。
2、目前用來檢測耐藥基因的方法已經有很多，常規的耐藥性測試是以微生物法為主，但這種方法的檢測流程過于復雜，并且需要的檢測周期太長。在臨床上，這種方法的檢測周期可能會超過重癥患者的治療窗口，對感染細菌信息的缺乏也可能會導致用藥不當，使患者錯過最佳的救治機會。因此科研人員找尋了幾種替代方法，免疫學方法的靈敏度較高，但是容易受抗體特異性以及基質背景的干擾。基于分子生物學的聚合酶鏈式反應(pcr)可以提供快速的檢測結論，但對于技術人員的專業性要求較高，并且需要昂貴的pcr儀，在部分資源匱乏的地區難以應用。由于這些方法都是基于實驗室的分析，急需開
3、crispr/cas是來源于古細菌體內的一種適應性免疫系統，在病毒侵入后crispr/cas系統可在rna的引導下通過切割作用來沉默外源基因的表達。研究人員發現了其在分子診斷領域的巨大應用潛力并基于此開發了大量的檢測方法。cas9中的一類變體被稱為dcas9，這種變體由于ruvc1和hnh結構域同時發生突變導致其剪切酶活性喪失，從而只保留了通過sgrna和pam序列靶向目標序列的能力。dcas9失去切割活性，因此可以對任何基因進行精準的定點調控而不損傷dna。使用dcas9對預擴增的靶標進行二次識別是提高檢測特異性的一個有效策略。此外，提高快速檢測方法的靈敏度及準確性也是需要解決的問題，近年來快速發展的納米酶由于自身的優良性質逐漸得到研究人員的青睞，與天然酶相比，納米酶在同樣具有催化活性的同時，還具有穩定性高、成本低、易于合成和修飾等特點，在生物傳感等方面具有巨大的潛力。研究表明，納米酶可以催化某些有機染料成為具有sers活性的分子，在基于sers的生物傳感中具有很大的前景。并且，納米酶具有較大的表面積并提供許多活性位點，從而顯著增加相互作用的信號分子的數量來提高檢測靈敏度。crispr/cas系統具有的靶向能力以及納米酶具有的優良催化活性和高穩定性，為開發一種簡單、穩定、高靈敏度的快速檢測方法提供了基礎。
4、盡管目前研究人員已經開發了大量的生物傳感器用于現場快速檢測致病菌，但是這些方法大部分都是單信號輸出，容易受系統誤差和環境因素的影響而產生較大的分析誤差。雙模態的檢測方法由于能夠同時輸出兩種信號，兩種信號互相修正，提高了檢測結果的準確性。因此雙模態的檢測方法更能夠滿足現場快速準確檢測的目的，目前的致病菌檢測市場急需這樣的方法來防止多粘菌素耐藥基因mcr-1的傳播從而維護人們身體健康。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于提供雙模態多粘菌素耐藥基因mcr-1檢測平臺，以解決上述
技術介紹
中提出的問題。
2、為實現上述目的，本專利技術提供如下技術方案：雙模態多粘菌素耐藥基因mcr-1檢測平臺，該方法包括以下步驟：
3、s1：將含有多粘菌素耐藥基因mcr-1的食品樣品與快速提取液混合后加熱裂解5-8min，獲得含多粘菌素耐藥基因mcr-1的溶液；
4、s2：采用針對多粘菌素耐藥基因mcr-1的引物組，在恒定溫度下進行lamp擴增一段時間，獲得生物素修飾的lamp雙鏈產物；
5、s3：將適量鏈霉親和素磁珠、dcas9蛋白、sgrna、金鉑納米探針和lamp雙鏈產物混合，并孵育一段時間，使用磁吸附技術將鏈霉親和素磁珠-dcas9/sgrna-lamp雙鏈產物-金鉑納米探針復合物富集，去除上清后重懸；
6、s4：加入3,3',5,5'-四甲基聯苯胺與h2o2反應數分鐘后肉眼觀察比色結果進行定性分析，隨后可通過紫外光譜測定以及sers光譜測定來對食品樣品中多粘菌素耐藥基因mcr-1含量進行定量分析。
7、優選的，所述快速提取液包含氯化鎂、edta、tris-hcl、十二烷基硫酸三乙醇胺、氯化鉀和水楊酸甲酯，十二烷基硫酸三乙醇胺質量體積分數為5％-10％，氯化鉀濃度為1.0-5.0mol/l。
8、優選的，所述引物組包括有第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物，所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物的序列分別如seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5和5’端用生物素標記的第六引物，所述第六引物由bio修飾，第六引物的序列如seq?id?no.6所示。
9、優選的，所述lamp擴增的引物組濃度為10-1000nmol/l，lamp擴增的恒定溫度為60-65℃，lamp擴增的時間為25-45min，鏈霉親和素磁珠濃度為2-20mg/ml，dcas9蛋白的濃度為50-500nmol/l，sgrna的序列如seq?id?no.7標記，sgrna濃度為40-400nmol/l。
10、優選的，所述金鉑納米探針中金鉑納米顆粒為20-50nm，金鉑納米探針的序列如seq?id?no.8標記，金鉑納米探針經過sh修飾，金鉑納米顆粒的制備方法包括：在2ml粒徑為20-40nm的金納米顆粒中加入40μl抗壞血酸后渦旋混勻，再加入1-5μl氯鉑酸后室溫下攪拌0.5-2h在4℃條件下儲存備用。
11、優選的，所述金鉑納米探針的制備方法包括以下步驟：
12、a1：將10μl濃度為10μm的金鉑納米探針、2μl濃度為1mm的tcep溶液和1μl濃度為500mm的乙酸緩沖液混合，乙酸緩沖液的ph為5.2，在黑暗環境中孵育0.5-1h，同時在2.0ml離心管中加入1ml金鉑納米顆粒，在8500rpm離心10min后去上清加入100μl超純水重懸后備用；
13、a2：將活化結束的金鉑納米探針加入步驟a1中100μl10倍濃縮的金鉑納米顆粒中，混合孵育1h讓兩者充分偶聯；
14、a3：加入2μl?10％牛血清蛋白溶液室溫孵育1h封閉金鉑納米顆粒上未偶聯探針的位點；
15、a4：在8500rpm離心10min去除過量的金鉑納米探針以及雜質離子，獲得的金鉑納米探針用100μl重懸液分散本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.雙模態多粘菌素耐藥基因MCR-1檢測平臺，其特征在于：該方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因MCR-1檢測平臺，其特征在于：所述快速提取液包含氯化鎂、EDTA、Tris-HCl、十二烷基硫酸三乙醇胺、氯化鉀和水楊酸甲酯，十二烷基硫酸三乙醇胺質量體積分數為5％-10％，氯化鉀濃度為1.0-5.0mol/L。
3.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因MCR-1檢測平臺，其特征在于：所述引物組包括有第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物，所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物的序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?IDNO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5和5’端用生物素標記的第六引物，所述第六引物由bio修飾，第六引物的序列如SEQ?ID?NO.6所示。
4.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因MCR-1檢測平臺，其特征在于：所述LAMP擴增的引物組濃度為10-1000nmol/L，LAMP擴增的恒定溫度為60-6
5.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因MCR-1檢測平臺，其特征在于：所述金鉑納米探針中金鉑納米顆粒為20-50nm，金鉑納米探針的序列如SEQ?ID?NO.8標記，金鉑納米探針經過SH修飾，金鉑納米顆粒的制備方法包括：在2mL粒徑為20-40nM的金納米顆粒中加入40μL抗壞血酸后渦旋混勻，再加入1-5μL氯鉑酸后室溫下攪拌0.5-2h在4℃條件下儲存備用。
6.根據權利要求5所述的雙模態多粘菌素耐藥基因MCR-1檢測平臺，其特征在于：所述金鉑納米探針的制備方法包括以下步驟：
7.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因MCR-1檢測平臺，其特征在于：所述金鉑納米探針體積為3-10μL，LAMP雙鏈產物體積為2-10μL，孵育時間為2-10min。
8.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因MCR-1檢測平臺，其特征在于：所述3,3',5,5'-四甲基聯苯胺的濃度為1.0-10mmol/L，H2O2的濃度為0.5-10％，反應時間為1-3min，SERS光譜測定條件為785nm、100mW。
9.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因MCR-1檢測平臺，其特征在于：該雙模態檢測平臺用于現場快速定量檢測被多粘菌素耐藥菌污染的食品樣品。
...【技術特征摘要】
1.雙模態多粘菌素耐藥基因mcr-1檢測平臺，其特征在于：該方法包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因mcr-1檢測平臺，其特征在于：所述快速提取液包含氯化鎂、edta、tris-hcl、十二烷基硫酸三乙醇胺、氯化鉀和水楊酸甲酯，十二烷基硫酸三乙醇胺質量體積分數為5％-10％，氯化鉀濃度為1.0-5.0mol/l。
3.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因mcr-1檢測平臺，其特征在于：所述引物組包括有第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物，所述第一引物、第二引物、第三引物、第四引物、第五引物、第六引物的序列分別如seq?id?no.1、seq?idno.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?id?no.5和5’端用生物素標記的第六引物，所述第六引物由bio修飾，第六引物的序列如seq?id?no.6所示。
4.根據權利要求1所述的雙模態多粘菌素耐藥基因mcr-1檢測平臺，其特征在于：所述lamp擴增的引物組濃度為10-1000nmol/l，lamp擴增的恒定溫度為60-65℃，lamp擴增的時間為25-45min，鏈霉親和素磁珠濃度為2-20mg/ml，dcas9蛋白的濃度為50-500nmol/l，sgrna的序列如seq?id?no.7標記，...
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。