【技術實現步驟摘要】
一、本專利技術涉及生物醫藥，特別是一種基于磁分離的滾環擴增超靈敏檢測gsk3β的方法。
技術介紹
0、二、
技術介紹
1、糖尿病腎臟疾病(dkd)是指由糖尿病所致的慢性腎臟疾病(ckd)，通常是根據尿白蛋白升高和/或估算的腎小球濾過率下降，同時排除其他ckd而做出的臨床診斷。dkd的臨床特征為逐漸進展的蛋白尿、漸進性腎功能下降，晚期出現嚴重腎衰竭，是糖尿病患者的主要死亡原因之一。單一的篩查指標判斷腎臟是否存在損傷可能存在一些缺陷，因此臨床中應結合多種輔助檢查方法來綜合判斷。同時應該增強對糖尿病腎臟損傷的重視程度，規范對糖尿病腎臟損傷的評估，加強dkd的早期預測與診斷。
2、目前，臨床上dkd的診斷依賴于腎功能的評估，通常通過計算估計的腎小球濾過率(egfr)和對腎損傷進行評估，評估腎損傷通常通過檢查隨機尿樣中的尿白蛋白與肌酐比值。
3、使用egfr作為dkd早期診斷的標志物存在一些潛在缺陷。首先，血清肌酐水平受肌肉質量和飲食模式(尤其是肉類攝入量)的影響，可能會干擾egfr的計算。其次，在某些情況下，所使用的公式也可能導致結果不準確。
4、白蛋白尿被認為是腎損傷尤其是腎小球功能障礙的標志物。通過檢查隨機尿樣中的白蛋白和肌酐水平來計算uacr是目前的臨床標準。然而，尿白蛋白排泄也可能因dkd以外的原因而增加，如體力活動、飲食模式、感染、發熱、充血性心力衰竭、高血糖、月經和高血壓。
5、在檢測早期dkd時，人們越來越關注使用尿白蛋白和肌酐以外的替代生物標志物，包括尿液、血液和
6、gsk3β(糖原合酶激酶3β)是一種高度保守的蘇氨酸/絲氨酸激酶，可激活糖原合酶。gsk3β作為葡萄糖代謝途徑的關鍵分子，參與多種細胞活動，在多種疾病中發揮關鍵作用，也是指示dkd進展的生物標志物，研究表明，gsk3β的表達水平與腎臟損傷，尤其是糖尿病腎病腎臟損傷的程度成正相關，可作為糖尿病腎臟損傷的生物標志物，但目前對于gsk3β在體液中的檢測方法，目前只有elisa法，且檢測的范圍有限。對于患者血清，尤其是尿液中gsk3β的表達水平較低的情況，elisa法檢測的靈敏度和檢測范圍明顯不足，且elisa法對于gsk3β的抗體依賴性較強，具有一定的局限性。因此，對于gsk3β檢測方法的改進和創新是目前亟需解決的問題。
技術實現思路
0、三、
技術實現思路
1、針對上述情況，為解決現有技術之缺陷，本專利技術之目的就是提供一種基于磁分離的滾環擴增超靈敏檢測gsk3β的方法，可有效解決目前檢測患者體液中某蛋白質表達的常用方法是elisa法，該方法的不足之處在于信號放大能力不足，檢測靈敏度有限的問題。
2、本專利技術解決的技術方案是，包括以下步驟：
3、1)制備抗體修飾磁珠
4、羧基修飾的磁珠與單抗抗體相連，磁分離去除未結合的單抗，得抗體修飾磁珠；
5、2)制備sh-dna修飾抗體
6、巰基修飾引物(sh-dna)與多抗抗體相連，通過12％?native-page電泳判斷反應前后的dna的條帶位置驗證dna與抗體的結合，得sh-dna修飾抗體；
7、3)滾環擴增(rca)反應
8、環模板通過磷酸和羥基未端的酶連接合成，通過模板介導的t4?dna連接酶連接成環，引物識別環模板的配對序列，在phi?29聚合酶的作用下合成重復線性單鏈dna/rna序列，包含重復的模板互補片段，rca反應按照下列反應體系混合試劑反應20-60min，得rca產物；
9、反應體系
10、
11、4)gsk3β蛋白檢測
12、用步驟1)制備的抗體修飾磁珠捕獲一定濃度梯度的gsk3β蛋白，磁分離并向磁珠沉淀加入步驟2)制備的sh-dna修飾抗體，磁分離并向磁珠沉淀中加入下列混合體系，磁分離后重懸加入步驟3)得到的rca產物；
13、混合體系
14、
15、
16、所述的環模板單鏈序列為:atacaataggactcaattctgctaacccgccctacccaatatcttcacctcgcatacagtccgggg，如seq?id?no.1所示。
17、所述的引物序列為：tcctattgtatccccggact，如seq?id?no.2所示。
18、所述的巰基修飾引物序列為：sh-tcctattgtatccccggact，如seq?id?no.3所示。
19、所述的rca產物為熒光互補寡核苷酸鏈，序列為：cy3-aacccgccctacccaatatc，如seq?id?no.4所示。
20、本專利技術所述的rca產物在制備檢測gsk3β蛋白試劑盒中的應用。
21、本專利技術可以實現多重蛋白檢測，通過滾換擴增的原理進行患者標本中gsk3β的超靈敏檢測，極大地提高了檢測靈敏度，可達fg級(fg/ml)；而市面上所使用的elisa檢測試劑盒，包括國外知名品牌如abcam,cell?signalling，invitrogen，均未達到ng/ml，且本專利技術方法可以使用多種檢測方式：如酶標儀、激光共聚焦、流式，是檢測gsk3β的方法上的創新。
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1.一種基于磁分離的滾環擴增超靈敏檢測GSK3β的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的基于磁分離的滾環擴增超靈敏檢測GSK3β的方法，其特征在于，所述的環模板單鏈序列為:ATACAATAGGACTCAATTCTGCTAACCCGCCCTACCCAATATCTTCACCTCGCATACAGTCCGGGG，如SEQ?ID?NO.1所示。
3.根據權利要求1所述的基于磁分離的滾環擴增超靈敏檢測GSK3β的方法，其特征在于，具體包括以下步驟：
4.權利要求1-3任一項方法得到的RCA產物在制備檢測GSK3β蛋白試劑盒中的應用。
【技術特征摘要】
1.一種基于磁分離的滾環擴增超靈敏檢測gsk3β的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的基于磁分離的滾環擴增超靈敏檢測gsk3β的方法，其特征在于，所述的環模板單鏈序列為:atacaataggactcaattctgctaacccgccctacccaatatct...
【專利技術屬性】
技術研發人員：郭佳，劉章鎖，張開翔，王慧，厲研菲，張艷梅，燕禹帆，毛子慧，陳嶄，
申請(專利權)人：鄭州大學第一附屬醫院，
類型：發明
國別省市：
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