【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及分子生物學，具體涉及一種豬lincrna4160組織表達對成肌細胞增殖、分化和凋亡影響的檢測方法及其應用。
技術介紹
1、骨骼肌是動物機體的重要組成部分，為生命活動提供結構支持、運動控制和能量儲存，骨骼肌發育是一個復雜而嚴格的調控過程，涉及成肌細胞的增殖、分化、凋亡等，骨骼肌的生長發育不僅影響畜禽的肌肉產量和品質，還影響人的運動能力和健康狀態。解析肌肉發育的分子調控機制不僅可指導畜牧生產，還有助于肌肉相關疾病的診斷和治療，深入闡明肌肉發育的分子機制對于畜禽育種和肌肉疾病的診治都具有重要意義。
2、骨骼肌的發育是一個錯綜復雜的調控網絡，由基因、轉錄因子、mirna、lncrna、circrna等協調有序調控，具體調控機制仍需探索。長鏈非編碼rna（lncrna）是一類主要由rna聚合酶ii轉錄、長度大于200?nt的核苷酸rna，比編碼基因具有更強的時空特異性。根據其與臨近編碼蛋白質基因的相對物理位置，可將lncrna分為正義lncrna，反義lncrna，雙向lncrna，基因間lncrna和基因內lncrna。近年來，隨著高通量測序技術的發展，發掘了大量與肌肉發育和肌肉疾病相關的長鏈非編碼rna，如lncmref與smarca5相互作用，促進p300/cbp/h3k27ac的基因組結合，上調成肌分化；tcons_00323213和pknox2解除了pknox2對myog啟動子的抑制作用，促進myog表達進而促進豬骨骼肌衛星細胞的分化；lncrna-meg3/mirna-133a-3p/prrt2軸可調
技術實現思路
1、針對上述存在的缺陷和問題，本專利技術提供一種豬lincrna4160組織表達對成肌細胞增殖、分化和凋亡影響的檢測方法及其應用，本專利技術基于前期高通量測序數據篩選出豬背最長肌發育相關的lincrna4160，首次證明lincrna4160可抑制豬肌肉衛星細胞增殖和分化，促進凋亡。
2、本專利技術解決其技術問題所采用的方案是：一種豬lincrna4160對成肌細胞增殖、分化和凋亡影響的檢測方法，包括以下步驟：
3、（1）樣品采集，提取總rna并合成cdna，實時定量pcr，以gapdh為內參基因，使用采用2－△△ct法計算基因相對表達量；
4、（2）對細胞培養、誘導分化和轉染，將si-lincrna4160和si-nc轉染到細胞中；
5、（3）lincrna4160表達譜分析，實時熒光定量pcr檢測lincrna4160在豬不同組織的表達量，豬骨骼肌衛星細胞30%、60%、90%匯合度和誘導分化d0、d2、d4、d6的表達量；
6、（4）提取組織或細胞的總蛋白，分析蛋白質印跡；采用edu檢測細胞增殖；采用流式細胞術檢測細胞周期，對線粒體膜電位染色，衡量線粒體膜電位的變化；
7、（5）在豬肌肉衛星細胞中分別轉染si-lincrna4160?和sinc，進行轉錄組測序分析，分析lincrna4160的具體調控機制；
8、（6）使用spss?22.0統計軟件進行差異顯著性檢驗，結果以mean?±?sem表示。
9、進一步的，所述步驟（1）中，使用ag?rnaex?pro試劑從組織和細胞中提取總rna；使用primescripttmrt?reagent?kit?with?gdna?eraser試劑盒將所提rna反轉錄合成cdna；使用sybr?premix?ex? taqtmⅱ試劑盒采用三步法進行實時熒光定量pcr，pcr反應體系：sybrpremix?ex? taqtmⅱ?12.5?μl，上、下游引物各1?μl，cdna模板2?μl，ddh2o?8.5?μl；pcr反應程序：95℃預變性3?min；95?℃變性30?s，58?℃退火30?s，72?℃延伸30?s，共40個循環。
10、進一步的，所述步驟（2）中，將樣品組織剪碎，在37℃使用膠原酶ii和胰蛋白酶消化，然后使用含有20%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素，1%?fgfb的dmem?f12培養基進行中和，通過差速貼壁法分離純化肌衛星細胞；誘導分化時，當細胞匯合度為70%~80%時，更換為分化培養基；使用dharmafect將si-lincrna4160和si-nc轉染到細胞中，使用dharmafect將si-lincrna4160和si-nc轉染到細胞中。
11、進一步的，所述步驟（3）中，使用實時熒光定量pcr檢測lincrna4160在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、胃、背最長肌、皮下脂肪的表達量。
12、進一步的，所述步驟（4）中，使用含有蛋白酶抑制劑的ripa提取組織或細胞的總蛋白；根據edu試劑盒說明書檢測細胞增殖；使用細胞周期檢測試劑盒檢測細胞周期。
13、進一步的，所述步驟（5）中，轉錄組測序分析步驟如下：總rna提取后，將oligo（dt）磁珠吸附帶polya的mrna用于cdna合成，在檢測cdna質量和含量后構建cdna文庫；在illumina平臺上使用pe150測序策略進行測序分析，從原始數據中去除接頭和低質量reads；對clean?data進行q20和q30計算以檢測測序錯誤率，采用hisat2軟件對cleanreads進行從頭組裝，用fpkm法進行基因表達分析；隨后，用deseq2方法進行組間差異表達分析；采用fdr<0.05，|log2(fold?change)|＞1作為篩選差異表達基因（deg）的標準；最后通過go分析進行deg功能注釋，以及kegg分析篩選deg富集的通路。
14、一種豬lincrna4160在調控成肌細胞增殖、分化和凋亡中的應用。
15、進一步的，所述lincrna4160可以抑制豬骨骼肌衛星細胞的增殖；lincrna4160可以抑制豬骨骼肌衛星細胞的分化；lincrna4160可以促進豬骨骼肌衛星細胞的凋亡過程。
16、進一步的，所述豬lincrna4160通過調控ankrd23、cenpk基因，經由肌肉疾病相關的通路和能量代謝相關通路，抑制豬肌肉衛星細胞的增殖和分化，促進凋亡。
17、本專利技術的有益效果：在本專利技術的研究中，通過分析lincrna4160的表達譜及其對豬肌肉衛星細胞增殖、分化、凋亡的調節作用，并使用轉錄組測序篩選了干擾lincrna4160的差異表達基因及其通路，rt-qpcr結果表明，lincrna4160在心肌和背最長肌表達量最高，在豬肌肉衛星細胞增殖和分化過程中，lincrna4160表達量均顯著下調，在豬肌肉衛星細本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種豬lincRNA4160組織表達的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的豬lincRNA4160組織表達的檢測方法，其特征在于，所述步驟（1）中，使用AG?RNAex?Pro試劑從組織和細胞中提取總RNA；使用PrimeScriptTMRT?ReagentKit?with?gDNA?Eraser試劑盒將所提RNA反轉錄合成cDNA；使用SYBR?Premix?Ex?TaqTMⅡ試劑盒采用三步法進行實時熒光定量PCR，PCR反應體系：SYBR?Premix?Ex?TaqTMⅡ?12.5?μL，上、下游引物各1?μL，cDNA模板2?μL，ddH2O?8.5?μL；PCR反應程序：95℃預變性3?min；95?℃變性30?s，58?℃退火30?s，72?℃延伸30?s，共40個循環。
3.根據權利要求1所述的豬lincRNA4160組織表達的檢測方法，其特征在于，所述步驟（2）中，將樣品組織剪碎，在37℃使用膠原酶II和胰蛋白酶消化，然后使用含有20%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素，1%?FGFb的DMEM?F12培養基進行中和，
4.根據權利要求1所述的豬lincRNA4160組織表達的檢測方法，其特征在于，所述步驟（3）中，使用實時熒光定量PCR檢測lincRNA4160在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、胃、背最長肌、皮下脂肪的表達量。
5.根據權利要求1所述的豬lincRNA4160組織表達的檢測方法，其特征在于，所述步驟（4）中，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA提取組織或細胞的總蛋白；根據EdU試劑盒說明書檢測細胞增殖；使用細胞周期檢測試劑盒檢測細胞周期。
6.根據權利要求1所述的豬lincRNA4160組織表達的檢測方法，其特征在于，所述步驟（5）中，轉錄組測序分析步驟如下：總RNA提取后，將Oligo（dT）磁珠吸附帶polyA的mRNA用于cDNA合成，在檢測cDNA質量和含量后構建cDNA文庫；在Illumina平臺上使用PE150測序策略進行測序分析，從原始數據中去除接頭和低質量Reads；對Clean?Data進行Q20和Q30計算以檢測測序錯誤率，采用HISAT2軟件對Clean?Reads進行從頭組裝，用FPKM法進行基因表達分析；隨后，用DESeq2方法進行組間差異表達分析；采用FDR?<0.05，|log2(Fold?Change)|＞1作為篩選差異表達基因（DEG）的標準；最后通過GO分析進行DEG功能注釋，以及KEGG分析篩選DEG富集的通路。
7.一種豬lincRNA4160在調控成肌細胞增殖、分化和凋亡中的應用。
8.根據權利要求7所述的豬lincRNA4160在調控成肌細胞增殖、分化和凋亡中的應用，其特征在于，所述lincRNA4160可以抑制豬骨骼肌衛星細胞的增殖；lincRNA4160可以抑制豬骨骼肌衛星細胞的分化；lincRNA4160可以促進豬骨骼肌衛星細胞的凋亡過程。
9.根據權利要求8所述的豬lincRNA4160在調控成肌細胞增殖、分化和凋亡中的應用，其特征在于，所述豬lincRNA4160通過調控Ankrd23、CENPK基因，經由肌肉疾病相關的通路和能量代謝相關通路，抑制豬肌肉衛星細胞的增殖和分化，促進凋亡。
...【技術特征摘要】
1.一種豬lincrna4160組織表達的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的豬lincrna4160組織表達的檢測方法，其特征在于，所述步驟（1）中，使用ag?rnaex?pro試劑從組織和細胞中提取總rna；使用primescripttmrt?reagentkit?with?gdna?eraser試劑盒將所提rna反轉錄合成cdna；使用sybr?premix?ex?taqtmⅱ試劑盒采用三步法進行實時熒光定量pcr，pcr反應體系：sybr?premix?ex?taqtmⅱ?12.5?μl，上、下游引物各1?μl，cdna模板2?μl，ddh2o?8.5?μl；pcr反應程序：95℃預變性3?min；95?℃變性30?s，58?℃退火30?s，72?℃延伸30?s，共40個循環。
3.根據權利要求1所述的豬lincrna4160組織表達的檢測方法，其特征在于，所述步驟（2）中，將樣品組織剪碎，在37℃使用膠原酶ii和胰蛋白酶消化，然后使用含有20%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素，1%?fgfb的dmem?f12培養基進行中和，通過差速貼壁法分離純化肌衛星細胞；誘導分化時，當細胞匯合度為70%~80%時，更換為分化培養基；使用dharmafect將si-lincrna4160和si-nc轉染到細胞中，使用dharmafect將si-lincrna4160和si-nc轉染到細胞中。
4.根據權利要求1所述的豬lincrna4160組織表達的檢測方法，其特征在于，所述步驟（3）中，使用實時熒光定量pcr檢測lincrna4160在心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、胃、背最長肌、皮下脂肪的表達量。
5.根據權利要求1所述的豬lincrna4160組織表達...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王璟，賈名揚，邢寶松，張琪，李佳禧，陳俊峰，閆祥洲，盧清俠，任巧玲，張家慶，潘傳英，孫加節，
申請(專利權)人：河南省農業科學院畜牧研究所，
類型：發明
國別省市：
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