【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于檢測分析，具體涉及一種基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法及其應用。
技術介紹
1、抗體偶聯藥物(antibody?drug?conjugate，adc)是通過連接子(linker)將靶向特異性抗原的抗體或抗體片段和具有細胞毒性的小分子偶聯形成的創新型生物治療藥物，因此adc兼具抗體藥物的高靶向性和clp小分子藥物的高活性，以降低全身毒性并更有選擇性地將有效載荷遞送至腫瘤細胞、腫瘤微環境或其他靶細胞中。因此，抗體偶聯藥物在腫瘤治療領域展現出了優秀的療效和極大的潛力，成為藥物研發的熱點。
2、藥物抗體偶聯率(drug-to-antibody?ratio，dar)表示每個抗體分子上偶聯的有效載荷的平均值，是抗體偶聯藥物的關鍵質量屬性，直接影響著產品的安全性和有效性。根據連接子和載荷的化學性質、與抗體的偶聯方式以及dar的異質性高低選擇適合的分析手段，目前，反相液相色譜法(rp-lc法)是常見的測定平均偶聯率的分析方法。
3、然而，現有的rp-lc方法并沒有考慮到小分子的吸光度貢獻對dar值測定的影響。隨著用于偶聯的小分子種類逐漸增多，研究發現一些小分子在抗體最大吸收波長280nm處有較大吸收。忽略小分子在280nm處的吸收會影響dar值的準確性。因此需要開發一種能夠檢測抗體偶聯藥物的dar值分析方法。
技術實現思路
1、針對現有技術存在的不足，本專利技術的目的在于提供一種基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法及
2、為達到此專利技術目的，本專利技術采用以下技術方案：
3、第一方面，本專利技術提供了一種基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，所述方法包括：
4、(s1)采用反相液相色譜對待測抗體偶聯藥物和clp小分子進行色譜檢測；所述抗體偶聯藥物的結構為抗體-連接子-毒素分子，所述clp小分子的結構為l-半胱氨酸-連接子-毒素分子；
5、(s2)基于檢測結果計算clp小分子的摩爾消光系數，根據抗體輕鏈、抗體重鏈和clp小分子的摩爾消光系數對液相色譜峰峰面積百分比進行校正；所述校正采用如下公式進行：
6、εlcn＝εlc0+n×εclp
7、εhcn＝εhc0+n×εclp
8、corrected?lcn％＝lcn％×εlc0/εlcn
9、corrected?hcn％＝hcn％×εhc0/εhcn
10、其中，εlcn表示抗體偶聯藥物偶聯n個連接子-毒素分子的輕鏈的摩爾消光系數；εhcn表示抗體偶聯藥物偶聯n個連接子-毒素分子的重鏈的摩爾消光系數；εlc0表示抗體輕鏈摩爾消光系數；εhc0表示抗體重鏈摩爾消光系數；εclp表示clp小分子的摩爾消光系數；lcn％表示抗體偶聯藥物偶聯n個連接子-毒素分子的輕鏈的液相色譜峰峰面積百分比；hcn％表示抗體偶聯藥物偶聯n個連接子-毒素分子的重鏈的液相色譜峰峰面積百分比；correctedlcn％表示抗體偶聯藥物偶聯n個連接子-毒素分子的輕鏈的校正后液相色譜峰峰面積百分比；correctedhcn％表示抗體偶聯藥物偶聯n個連接子-毒素分子的重鏈的校正后液相色譜峰峰面積百分比；
11、(s3)基于校正后的液相色譜峰峰面積百分比計算抗體偶聯藥物平均偶聯率。
12、現有的反相液相色譜法是根據待測物質疏水性的大小進行分離，通過還原抗體偶聯藥物得到輕鏈和重鏈，通過計算各輕、重鏈的峰面積百分比，結合每個峰偶聯小分子的個數，計算加權平均dar值。但現有方法并未考慮到clp在蛋白最大吸收波長280?nm處對峰面積的貢獻，會影響計算dar值的準確性。
13、本專利技術開發了一種能夠檢測抗體偶聯藥物的dar值分析方法，且在該方法基礎上通過小分子消光系數校正的方法得到準確的dar值，從而消除小分子的紫外吸收對dar測定的影響；同時，對于半胱氨酸偶聯的adc，用于消光系數校正的小分子是l-半胱氨酸-連接子-毒素分子(clp)，而非連接子-毒素分子(lp)，通過clp充分模擬偶聯在抗體上的lp的紫外吸收。
14、優選地，步驟(s3)中，所述抗體偶聯藥物平均偶聯率采用如下公式計算：
15、corrected?darlc＝2×σn×corrected?lcn％/σcorrected?lcn％
16、corrected?darhc＝2×σn×corrected?hcn％/∑corrected?hcn％
17、corrected?dar＝corrected?darlc+corrected?darhc
18、其中，corrected?darlc表示校正后的抗體偶聯藥物輕鏈的平均偶聯率；
19、corrected?darhc表示校正后的抗體偶聯藥物重鏈的平均偶聯率；
20、corrected?dar表示校正后的平均偶聯率。
21、優選地，步驟(s1)中，所述色譜檢測采用梯度洗脫的方式進行。
22、優選地，所述洗脫采用的流動相包括流動相a和流動相b，所述流動相a為0.05％-0.1％三氟乙酸水溶液，例如可以是0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％等，所述流動相b為0.05％-0.1％三氟乙酸乙腈溶液，例如可以是0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％或0.1％等。
23、優選地，所述梯度洗脫程序包括：
24、第0-2min，流動相b的體積分數為30.0-31.0，其余為流動相a；
25、第2-35min，流動相b的體積分數由30.0-31.0勻速變為46.5-47.0，其余為流動相a；
26、第35-35.1min，流動相b的體積分數由46.5-47.0勻速變為90.0-91.0，其余為流動相a；
27、第35.1-40min，流動相b的體積分數為90.0-91.0，其余為流動相a；
28、第40-40.1min，流動相b的體積分數由90.0-91.0勻速變為30.0-31.0，其余為流動相a；
29、第40.1-42min，流動相b的體積分數為30.0-31.0，其余為流動相a。
30、作為本專利技術的一個優選實施方式，所述梯度洗脫程序包括：
31、
32、
33、優選地，所述色譜檢測的檢測波長λ＝280本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，步驟(S3)中，所述抗體偶聯藥物平均偶聯率采用如下公式計算：
3.根據權利要求1或2所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，步驟(S1)中，所述色譜檢測采用梯度洗脫的方式進行；
4.根據權利要求3所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，所述梯度洗脫程序包括：
5.根據權利要求1-4中任一項所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，所述色譜檢測的檢測波長λ＝280nm；
6.根據權利要求1-5中任一項所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，步驟(S1)中，所述CLP小分子采用包括如下步驟的方法制備得到：將連接子-毒素分子與L-半胱氨酸振蕩反應，得到偶聯的CLP小分子；
7.根據權利要求1
8.根據權利要求1-7中任一項所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，所述CLP小分子的摩爾消光系數采用包括如下步驟的方法計算得到：
9.根據權利要求8所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，所述溶劑為0.05％-0.1％三氟乙酸乙腈溶液和0.05％-0.1％三氟乙酸水溶液的混合液；
10.權利要求1-9中任一項所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法在抗體偶聯藥物平均偶聯率檢測中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據權利要求1所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，步驟(s3)中，所述抗體偶聯藥物平均偶聯率采用如下公式計算：
3.根據權利要求1或2所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，步驟(s1)中，所述色譜檢測采用梯度洗脫的方式進行；
4.根據權利要求3所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，所述梯度洗脫程序包括：
5.根據權利要求1-4中任一項所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，所述色譜檢測的檢測波長λ＝280nm；
6.根據權利要求1-5中任一項所述的基于小分子消光系數校正的抗體偶聯藥物平均偶聯率的檢測方法，其特征在于，步驟(s1)中，所述clp小分子采用包括如下步驟的方...
【專利技術屬性】
技術研發人員：路楠，吳佳琦，田夢薇，鄭子諒，張山山，田橙，李志國，
申請(專利權)人：上海藥明合聯生物技術有限公司，
類型：發明
國別省市：
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