【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基因工程，特別涉及一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體、枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、目前，牛乳鐵蛋白（bovine?lactoferrin，blf）的制備方法主要有2種：第一種是從食品中分離得到，在分離過程中主要通過超濾法、透析法、硫酸銨沉淀法以及膜過濾等方法獲得；第二種方法是利用微生物的重組表達(dá)系統(tǒng)獲得。從牛乳中提取blf效率低且成本較高，利用重組表達(dá)系統(tǒng)異源表達(dá)blf是目前科學(xué)研究的熱點(diǎn)。blf的重組表達(dá)系統(tǒng)有細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)、真菌表達(dá)系統(tǒng)和轉(zhuǎn)基因哺乳動物。此外，重組產(chǎn)物的表達(dá)量及其與天然乳鐵蛋白的結(jié)構(gòu)相似度也在不斷提升。
2、枯草芽孢桿菌（bacillus?subtilis）是目前公認(rèn)的食品安全級微生物，具有高效、可溶性、安全、適應(yīng)性廣泛、質(zhì)粒穩(wěn)定性高和成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，也是典型的分泌表達(dá)模式菌株。通過分泌表達(dá)，可以減少后續(xù)的蛋白純化步驟，節(jié)省工業(yè)化生產(chǎn)的成本，是目前廣泛應(yīng)用的表達(dá)系統(tǒng)之一。
3、但由于牛乳鐵蛋白具有廣譜抑菌性，在枯草芽孢桿菌中異源表達(dá)blf會對宿主產(chǎn)生毒害作用，對細(xì)胞的生長造成較大影響。此外，blf的分子量≥80?kda，導(dǎo)致枯草芽孢桿菌難以將其分泌表達(dá)。即目前blf在枯草芽孢桿菌表達(dá)系統(tǒng)中存在表達(dá)困難，表達(dá)量低和難以分泌等問題，且大多數(shù)研究集中在blf片段的表達(dá)，鮮少有全長牛乳鐵蛋白在枯草芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)的報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于提供一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體、枯草芽孢桿菌及
2、第一方面，本專利技術(shù)提供一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體，表達(dá)載體以pma5為骨架構(gòu)建而成，表達(dá)載體中依次含有啟動子、優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因，啟動子和優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因之間還連接有信號肽的編碼基因，信號肽為spywbn、spamye、spphob或sppel。
3、進(jìn)一步地，spywbn的氨基酸序列如seq?id?no?.8所示。
4、spamye的氨基酸序列如seq?id?no?.2所示。
5、spphob的氨基酸序列如seq?id?no?.4所示。
6、sppel的氨基酸序列如seq?id?no?.6所示。
7、優(yōu)選的，spywbn編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no?.9所示。
8、spamye編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no?.3所示。
9、spphob編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no?.5所示。
10、sppel編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no?.7所示。
11、進(jìn)一步地，優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因的核苷酸序列如seq?id?no?.1所示。
12、進(jìn)一步地，啟動子為串聯(lián)雙啟動子，串聯(lián)雙啟動子為：在啟動子pylbp上游串聯(lián)啟動子phpaⅱ。
13、進(jìn)一步地，啟動子pylbp的核苷酸序列如seq?id?no?.12所示；啟動子phpaⅱ的核苷酸序列如seq?id?no?.13所示。
14、第二方面，本專利技術(shù)提供一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
15、pcr擴(kuò)增優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因，對骨架載體pma5進(jìn)行雙酶切，將優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因和骨架載體pma5的雙酶切產(chǎn)物使用t4?dna連接酶進(jìn)行連接，得到質(zhì)粒pma5-blf。
16、使用限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒pma5-blf進(jìn)行單酶切，將單酶切得到的線性化載體與pcr擴(kuò)增后的信號肽的編碼基因通過無縫克隆的方法進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒。
17、以重組質(zhì)粒為模板，pcr擴(kuò)增去除重組質(zhì)粒上的原有的啟動子并得到線性化載體，將pcr擴(kuò)增后的線性化載體與pcr擴(kuò)增后的啟動子通過無縫克隆的方法進(jìn)行連接，得到分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體。
18、第三方面，本專利技術(shù)提供一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌含有任一上述表達(dá)載體；枯草芽孢桿菌為b.?subtilis?wb600。
19、第四方面，本專利技術(shù)提供一種上述分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，包括以下步驟：
20、將活化后的枯草芽孢桿菌接種到spⅰ培養(yǎng)基中培養(yǎng)，當(dāng)菌體生長至對數(shù)生長末期，取菌液接種至spⅱ培養(yǎng)基中培養(yǎng)1.5~2h，加入egta溶液繼續(xù)培養(yǎng)10~15min，得到枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞。
21、將分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，得到分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的枯草芽孢桿菌。
22、第五方面，本專利技術(shù)提供一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體的應(yīng)用，將上述表達(dá)載體應(yīng)用于生產(chǎn)牛乳鐵蛋白。
23、第六方面，本專利技術(shù)提供一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，將上述枯草芽孢桿菌應(yīng)用于生產(chǎn)牛乳鐵蛋白。
24、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)的分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體具有如下技術(shù)效果：
25、（1）與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)以pma5為骨架構(gòu)建的分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體中，依次含有啟動子、優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因，該優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因是根據(jù)宿主菌株的密碼子偏好性優(yōu)化得到的，可以在啟動子的調(diào)控下在宿主菌株中順利表達(dá)牛乳鐵蛋白，而不會對宿主菌株產(chǎn)生毒害作用。并且，本專利技術(shù)構(gòu)建的表達(dá)載體中在啟動子和優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因之間還連接有信號肽的編碼基因，該信號肽為spywbn、spamye、spphob或sppel，這幾種信號肽均可以實(shí)現(xiàn)牛乳鐵蛋白的分泌表達(dá)，提高牛乳鐵蛋白的分泌表達(dá)量，從而簡化后續(xù)牛乳鐵蛋白的分離純化流程，節(jié)約生產(chǎn)成本。
26、（2）本專利技術(shù)分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體中含有的牛乳鐵蛋白基因是根據(jù)枯草芽孢桿菌的密碼子偏好性優(yōu)化得到的全長牛乳鐵蛋白基因，含有該優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌后，可以在枯草芽孢桿菌中順利表達(dá)全長的牛乳鐵蛋白，該全長牛乳鐵蛋白具有活性且對宿主無毒害作用。
27、（3）本專利技術(shù)分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體中的啟動子為串聯(lián)雙啟動子，并限定了串聯(lián)雙啟動子的具體選擇，相較于單啟動子，該串聯(lián)雙啟動子進(jìn)一步提高了牛乳鐵蛋白在宿主菌株中的分泌表達(dá)水平。
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1.一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體以pMA5為骨架構(gòu)建而成，所述表達(dá)載體中依次含有啟動子、優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因，所述啟動子和優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因之間還連接有信號肽的編碼基因，所述信號肽為SPywbN、SPamyE、SPPhoB或SPpel。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述SPywbN的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.8所示；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?.1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述啟動子為串聯(lián)雙啟動子，所述串聯(lián)雙啟動子為：在啟動子Pylbp上游串聯(lián)啟動子PHpaⅡ。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述啟動子Pylbp的核苷酸序列如SEQID?NO?.12所示；所述啟動子PHpaⅡ的核苷酸序列如SEQ?ID?NO?.13所示。
6.一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的枯草芽孢桿
8.一種權(quán)利要求7所述的分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求1~5任一所述的表達(dá)載體應(yīng)用于生產(chǎn)牛乳鐵蛋白。
10.一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的枯草芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，將權(quán)利要求7所述的枯草芽孢桿菌應(yīng)用于生產(chǎn)牛乳鐵蛋白。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種分泌表達(dá)牛乳鐵蛋白的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體以pma5為骨架構(gòu)建而成，所述表達(dá)載體中依次含有啟動子、優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因，所述啟動子和優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因之間還連接有信號肽的編碼基因，所述信號肽為spywbn、spamye、spphob或sppel。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述spywbn的氨基酸序列如seq?id?no.8所示；
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述優(yōu)化的牛乳鐵蛋白基因的核苷酸序列如seq?id?no?.1所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述啟動子為串聯(lián)雙啟動子，所述串聯(lián)雙啟動子為：在啟動子pylbp上游串聯(lián)啟動子phpaⅱ。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述啟動子pyl...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：朱理平，徐良平，王濱，王雅珣，
申請(專利權(quán))人：諸城市浩天藥業(yè)有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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