【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及天然活性產物的提取富集純化改性制備乙酰膽堿酯酶抑制劑的天然植物化學，具體涉及的是一種利用生物酶綠色高效將皂角刺雙鏈皂苷水解為單鏈皂苷的技術。
技術介紹
1、皂苷是植物中豐富的次生代謝物，在動植物細胞中，皂苷以非功能性形式積累。當遇到病原體時，皂苷在植物酶的作用下轉化為活性抗生素。皂苷在植物中分布廣泛，在植物的根、莖、葉、花中均有分布，在不同的部位的含量和種類差異較大。但皂苷的結構總是包含兩個不同的部分，即極性三萜或甾體苷元和極性低聚糖（糖基）部分。皂苷分為單糖苷（單糖鏈與苷元的c-3相連）和雙糖苷（一條糖鏈與苷元的c-3相連，第二條糖鏈與苷元的c-28、c-27、c-26或c-22相連）。
2、皂苷是一種非揮發性化合物，極性（糖鏈）和非極性（苷元）基團的存在使它們成為表面活性化合物，具有潤濕、乳化和發泡性能。皂苷在水溶液體系中具有表面活性性質，脂溶性苷元和水溶性低聚糖鏈之間的連接使皂苷具有兩親性分子加工表面活性劑的特性，從而導致皂苷與細胞膜之間的相互作用。由于這種相互作用，皂苷對生物體表現出多種生物效應，如膜滲透、溶血、殺蟲、和抗真菌活性。
3、研究表明，皂苷具有驅避或阻嚇作用、可引起昆蟲蛻皮缺陷或引起細胞毒性，皂苷獨特的結構性質以及前期研究對皂苷殺蟲性能的篩選表明其作為生物農藥擁有具有巨大的潛質。皂苷對蚜蟲、甲蟲、象鼻蟲、葉蟬、蠕蟲、飛蛾等昆蟲均具有顯著的殺蟲潛力，減少害蟲食物攝入量，產生消化不良，體重減輕，發育遲緩，繁殖率降低等情況。皂苷作用于昆蟲的主要機制有：影響昆蟲消化系統，強化昆蟲
4、在c-3處有糖基的單粘連皂苷比在c-28處有糖基的單粘連皂苷更具有生物活性，皂角刺皂苷多為齊墩果酸型皂苷，齊墩烷型三萜皂苷被歸類為三萜糖苷，有兩個糖鏈與苷元相連，沒有游離羧基，為雙鏈皂苷。因此對c-28位上糖基進行特異性水解使其水解為單鏈皂苷能夠有效提高其生物活性。然而對皂苷的水解多停留在酸水解或堿水解等廣譜性水解范圍內，沒有對皂苷針對性水解。生物酶具有作用于特定生物靶點的作用，因此利用生物酶對皂苷的特定片段進行水解，作用于特定位置的同時不會破壞皂苷原有的結構，對皂苷結構進行定向改造增強皂苷殺蟲活性。
5、皂苷具有水溶性好，安全性高、抗菌效果強、抗菌譜廣、水溶性好等特點成為研究熱點。但對于皂苷的研究相對較少，其作用機制停留在對生物膜的破壞作用研究上，因此探究皂苷的抗菌機制具有重要意義。
技術實現思路
1、專利技術要解決的技術問題在于克服原有水解技術的無定向水解，提供一種綠色高效定向水解方式，將活性較低的皂角刺雙鏈皂苷轉化高活性的皂角刺單鏈皂苷。本方法工藝簡單，生產成本低。同時，本方法開發了一種表征羧酸酯酶對皂角刺皂苷水解率的方法，方法簡單高效。
2、為解決以上技術問題，本專利技術采用技術方案的基本構思是：
3、一種具有高抑制乙酰膽堿酶活性的皂角刺皂苷水解物的制備方法，具體涉及一種皂角刺總皂苷及其高乙酰膽堿酯酶抑制活性低糖基皂苷元的制備方法：主要包括以下步驟：
4、s1：皂角刺總皂苷的提取及制備：以皂角刺粉末為原料，用60%乙醇超聲提取一次，濃縮液晶水飽和正丁醇萃取3-5次后，將萃取液合并減壓濃縮，加水復溶1-3次，減壓濃縮，冷凍干燥后采用石油醚索氏提取除去其中脂質，干燥后制備成皂角刺總皂苷干粉。
5、s2：皂角刺總皂苷的洗脫及餾分收集制備：以s1取得的皂苷為原料，水溶解后采用d101濕法上樣，負載后用10%-90%乙醇進行洗脫，收集不同餾分，減壓濃縮，加水復溶1-3次，減壓濃縮，冷凍干燥后得到不同洗脫餾分干燥粉。
6、s3：皂角刺皂苷綠色定向水解：采用羧酸酯酶對純度最高的皂角刺總皂苷洗脫餾分進行水解，定向將齊墩果酸型皂苷的c28位上酯基水解為羧酸及低聚糖。
7、s4：一種皂角刺皂苷羧酸酯酶水解率測定：水解后皂苷體系減壓濃縮后加入無水乙醇醇沉低聚糖，通過苯酚-硫酸法測定醇沉物中總糖含量，通過總糖質量計算水解率。
8、s5：乙酰膽堿酯酶抑制活性：對皂角刺提取物、總皂苷、各洗脫餾分、水解皂苷進行乙酰膽堿酯酶活性抑制，以石杉堿甲為陽性對照。
9、所述的皂角刺粉水分應低于6%，且過60目篩后方可用于提取，提取溶劑為60%乙醇，提取溫度為40?min，液料比為20?ml/g，超聲功率為360?w。
10、所述的抽濾、減壓蒸發壓強保持在-0.01mpa?~?-1mpa，旋轉蒸發除去乙醇溫度為45?℃，除去正丁醇溫度為65?℃，冷凍干燥溫度在-30?℃，冷凍干燥時間為3-4?d。
11、d101大孔樹脂事先應用乙醇浸泡24?h，去離子水沖洗無乙醇味等預處理操作，皂角刺總皂苷洗脫流速為5?ml/min，洗脫體積為1-2個柱體積。
12、皂角刺皂苷水解中羧酸酯酶的用量為150?u，作用環境為ph=7，溫度為37?℃。
13、對皂角刺水解物濃縮體積為原體積的1/20，低聚糖的醇沉乙醇使用量為濃縮液50倍體積。
14、有益效果：
15、本專利技術首次使用羧酸酯酶對皂角刺總皂苷進行綠色定向水解，目標指向皂角刺皂苷中齊墩果酸型皂苷c28位上酯基，旨在將酯基水解為羧酸，去除雙鏈皂苷中其中c28位置上糖基片段。不同于傳統酸/堿水解的不確定性，本專利技術的羧酸酯酶水解具有特異性針對酯基的水解。
16、（2）首次通過無水乙醇醇沉低聚糖的方式定量了皂角刺皂苷的水解率，分離了富含皂角刺單鏈皂苷。
17、（3）通過乙酰膽堿酯酶體外抑制活性驗證了水解后的單鏈皂苷具有更為高效的乙酰膽堿酯酶抑制活性，為后續研究皂苷結構對殺蟲效果影響具有重要意義。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種具有高抑制乙酰膽堿酶活性的皂角刺皂苷水解物的制備方法，具體步驟：
2.S2：皂角刺總皂苷的餾分洗脫：以S1取得的皂角刺總皂苷為原料，采用D101大孔樹脂對總皂苷進行洗脫獲取更高純度的皂苷。使用10%-90%乙醇對皂角刺皂苷進行洗脫，收集不同洗脫液旋轉蒸發后冷凍干燥得到皂角刺總皂苷不同洗脫餾分。
3.S3：一種皂角刺皂苷綠色定向水解方法：采用羧酸酯酶對S2中洗脫餾分中純度最高的皂角刺皂苷進行水解，定向水解皂角刺皂苷中C28位酯基，將酯基水解為C28位羧基及低聚糖片段。
4.S4：一種皂角刺皂苷羧酸酯酶水解率測定：水解后的單鏈皂角刺皂苷減壓濃縮后加入無水乙醇醇沉低聚糖，通過低聚糖質量計算皂角刺皂苷羧酸酯酶水解率。
5.S5：一種乙酰膽堿酯酶抑制率測定：對皂角刺提取物，皂角刺總皂苷，皂角刺總皂苷洗脫餾分，皂角刺單鏈皂苷水解產物的乙酰膽堿酯酶抑制率進行測定評估。
6.根據權利要求1所述的一種皂角刺總皂苷及其高活性低糖基皂苷元的制備方法，其特征在于，S1皂角刺粉末應過60目篩且水分不超過6%，方可用于后續提取。提取溫度為5
7.根據權利要求1所述的一種皂角刺總皂苷及其高活性低糖基皂苷元的制備方法，其特征在于，S2中所述D101大孔樹脂應事先作預處理操作，將購置樹脂用無水乙醇浸泡24?h除去殘缺破碎顆粒后，用去離子水反復沖洗至沒有乙醇。采用濕法裝柱和濕法上樣，洗脫相流速為5?mL/min，收集10%，30%，50%，70%，90%洗脫相。
8.根據權利要求1所述的一種皂角刺總皂苷及其高活性低糖基皂苷元的制備方法，其特征在于，S3中羧酸酯酶用量為150?U，水解環境為pH=7.0，溫度為37?℃。
9.根據權利要求1所述的一種皂角刺總皂苷及其高活性低糖基皂苷元的制備方法，其特征在于，S3，S4中羧酸酯酶水解皂角刺皂苷步驟為：酶水解→離心→旋轉蒸發濃縮→醇沉低聚糖→離心分離低聚糖→收集上清液→上清液濃縮→水解皂苷。
10.根據權利要求1所述的一種皂角刺總皂苷及其高活性低糖基皂苷元的制備方法，其特征在于，S4中是對皂角刺總皂苷洗脫餾分中純度最高的皂苷進行水解。采用50倍濃縮液體積乙醇醇沉低聚糖，離心機為5000?r/min。水解率為產生的總糖質量除以水解前皂苷質量。
...【技術特征摘要】
1.一種具有高抑制乙酰膽堿酶活性的皂角刺皂苷水解物的制備方法，具體步驟：
2.s2：皂角刺總皂苷的餾分洗脫：以s1取得的皂角刺總皂苷為原料，采用d101大孔樹脂對總皂苷進行洗脫獲取更高純度的皂苷。使用10%-90%乙醇對皂角刺皂苷進行洗脫，收集不同洗脫液旋轉蒸發后冷凍干燥得到皂角刺總皂苷不同洗脫餾分。
3.s3：一種皂角刺皂苷綠色定向水解方法：采用羧酸酯酶對s2中洗脫餾分中純度最高的皂角刺皂苷進行水解，定向水解皂角刺皂苷中c28位酯基，將酯基水解為c28位羧基及低聚糖片段。
4.s4：一種皂角刺皂苷羧酸酯酶水解率測定：水解后的單鏈皂角刺皂苷減壓濃縮后加入無水乙醇醇沉低聚糖，通過低聚糖質量計算皂角刺皂苷羧酸酯酶水解率。
5.s5：一種乙酰膽堿酯酶抑制率測定：對皂角刺提取物，皂角刺總皂苷，皂角刺總皂苷洗脫餾分，皂角刺單鏈皂苷水解產物的乙酰膽堿酯酶抑制率進行測定評估。
6.根據權利要求1所述的一種皂角刺總皂苷及其高活性低糖基皂苷元的制備方法，其特征在于，s1皂角刺粉末應過60目篩且水分不超過6%，方可用于后續提取。提取溫度為50℃，提取時間為40?min，液料比為20?ml/g。減壓抽濾除去乙醇溫度為45?℃，除...
【專利技術屬性】
技術研發人員：黃立新，劉勇，謝普軍，鄧葉俊，張彩虹，
申請(專利權)人：中國林業科學研究院林產化學工業研究所，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。