【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及基于嗅上皮類器官構(gòu)建的嗅覺障礙體外模型及其應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、嗅覺是人類生活中必不可少的一種感覺功能，對(duì)人類生活質(zhì)量的影響存在于方方面面，嗅覺能夠通過食欲和食物偏好影響人體的營(yíng)養(yǎng)狀況，幫助人們快速識(shí)別環(huán)境中存在的危險(xiǎn)(例如天然氣泄漏、火災(zāi)、危險(xiǎn)的化學(xué)氣體和腐爛的食物等)。嗅覺功能障礙不僅影響人們的身體健康、降低生活質(zhì)量、提高個(gè)體死亡率，其還是許多重大神經(jīng)退行性疾病(如阿爾茨海默癥、帕金森氏病等)的首發(fā)癥狀。
2、嗅覺障礙的致病因素很多，其中重要的因素包括慢性炎癥、基底細(xì)胞失活和神經(jīng)元退化等。慢性炎癥引起的嗅覺功能喪失主要由慢性鼻竇炎引起，其是一種常見的影響鼻內(nèi)黏膜的炎癥疾病，引起的嗅覺減退和障礙是由黏膜水腫或息肉造成的氣味傳遞阻塞所致。動(dòng)物模型和臨床研究表明嗅上皮中的炎癥反應(yīng)能夠引起氣味識(shí)別和嗅覺感知的臨時(shí)和可逆的障礙，而長(zhǎng)期的炎癥導(dǎo)致嗅神經(jīng)上皮的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變并被呼吸上皮所取代。因此，慢性鼻竇炎導(dǎo)致的嗅覺障礙是一種炎癥誘導(dǎo)且與感覺神經(jīng)相關(guān)的疾病。
3、由于嗅覺障礙的發(fā)病機(jī)制不明，目前仍無針對(duì)性的治療方法，常用的手段包括以皮質(zhì)類固醇激素為主的藥物治療、嗅覺訓(xùn)練和手術(shù)治療。嗅覺障礙致病機(jī)制研究的疾病模型依然缺乏，主要還是依賴于動(dòng)物模型，包括脂多糖(lps)誘導(dǎo)的鼻竇炎模型、甲基吲哚誘導(dǎo)的嗅覺損傷模型、神經(jīng)元轉(zhuǎn)導(dǎo)缺陷和炎癥因子相關(guān)的轉(zhuǎn)基因小鼠。嗅覺障礙疾病的體外模型依然未見報(bào)道，如果建立一種有效的細(xì)胞模型以替代動(dòng)物模型，不僅可以大大減少動(dòng)物的使用量以提高動(dòng)物福利，其低成本、易于維持和便于實(shí)驗(yàn)操作
4、類器官是由干細(xì)胞發(fā)育而成的三維結(jié)構(gòu)，能夠準(zhǔn)確地反映組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞組成。類器官可以來源于兩種類型的干細(xì)胞，包括多能干細(xì)胞(包括胚胎干細(xì)胞和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞)以及器官特異性成體干細(xì)胞。利用上述兩種細(xì)胞，科學(xué)家已成功建立了多種重要器官如腦、胃、腸、肺、肝和腎的類器官，類器官通常來自健康或病變組織，是研究組織穩(wěn)態(tài)和再生以及疾病發(fā)生機(jī)制的良好模型。嗅上皮中具有組織特異性干細(xì)胞，是體外培育類器官的理想組織來源。類器官可在穩(wěn)定傳代的同時(shí)保持遺傳穩(wěn)定性，其技術(shù)的發(fā)展已為臨床前治療方法的測(cè)試和開發(fā)開辟了新的途徑。目前，類器官已用于多種臨床應(yīng)用，包括疾病建模、藥物篩選、宿主-微生物相互作用和再生治療，患者來源的類器官使實(shí)現(xiàn)個(gè)體化精準(zhǔn)醫(yī)療成為可能。利用患者類器官進(jìn)行高通量藥物篩選已成為目前腫瘤研究的趨勢(shì)，在大多數(shù)情況下，患者源性類器官的測(cè)試結(jié)果可以預(yù)測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)。另外，研究發(fā)現(xiàn)，利用分子技術(shù)如慢病毒表達(dá)系統(tǒng)和crispr/cas9，可以在類器官中操縱基因，使得疾病建模和靶向基因治療成為可能，例如囊性纖維化(cf)是一種由囊性纖維化跨膜電導(dǎo)調(diào)節(jié)(cftr)基因突變引起的常染色體隱性遺傳疾病，在患者來源的腸道類器官中，利用crispr/cas9系統(tǒng)進(jìn)行同源重組糾正了cftr位點(diǎn)的d508突變，校正后的cftr通道恢復(fù)正常生理功能。因此，類器官可以作為研究疾病發(fā)病機(jī)制和制定治療方案的理想模型。
5、因此，針對(duì)動(dòng)物模型存在構(gòu)建周期長(zhǎng)、成本高、難以維持、操作不便等問題，有必要研發(fā)一種嗅上皮類器官模型，使其成為替代嗅覺障礙小鼠模型的一個(gè)理想工具，用于探索嗅覺障礙的發(fā)病機(jī)制，鑒定致病基因及建立嗅覺障礙治療的新方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的是建立一種嗅上皮類器官模型，使其成為替代嗅覺障礙小鼠模型的一個(gè)理想工具，用于探索嗅覺障礙的發(fā)病機(jī)制，鑒定致病基因及建立嗅覺障礙治療的新方法。
2、本專利技術(shù)采用的技術(shù)方案是：
3、基于嗅上皮類器官構(gòu)建的嗅覺障礙體外模型的構(gòu)建方法，所述方法包括以下之一：
4、(一)慢性鼻竇炎模型：11周齡的c57/bl小鼠，每周三次鼻腔滴注lps，滴注計(jì)量為1μg/10g，第一次給藥后21天處死小鼠，取小鼠嗅上皮進(jìn)行類器官培養(yǎng)，得到慢性鼻竇炎體外模型；
5、(二)急性鼻竇炎模型：11周齡的c57/bl小鼠，連續(xù)7天鼻腔滴注lps，滴注計(jì)量為1μg/10g，7天后處死小鼠，取小鼠嗅上皮進(jìn)行類器官培養(yǎng)，得到急性鼻竇炎體外模型；
6、(三)取6周齡cyp2g1-rtta/tre?tnf-α小鼠的嗅上皮進(jìn)行類器官培養(yǎng)，在類器官培養(yǎng)成熟后，在培養(yǎng)基中添加多西環(huán)素，多西環(huán)素的用量為1～10μg/ml，通過四環(huán)素反應(yīng)元件(tre)控制tnf-α的生成，添加多西環(huán)素處理24小時(shí)后獲得嗅上皮類器官體外炎癥第一模型：
7、(四)在6-8周齡cyp2g1-rtta/tre?tnf-α小鼠生長(zhǎng)過程中，多西環(huán)素飲食5個(gè)月，飲食計(jì)量為0.625g/kg，取該小鼠嗅上皮進(jìn)行類器官培養(yǎng)，獲得嗅上皮類器官體外炎癥第二模型：
8、(五)取6周齡的野生型小鼠嗅上皮進(jìn)行類器官培養(yǎng)，在培養(yǎng)基中直接添加外源性tnf-α，tnf-α的添加量為5～10ng/ml，處理72小時(shí)，獲得嗅上皮類器官體外炎癥第三模型。
9、所述方法中，所述類器官培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基成分如下：
10、dmem/f12培養(yǎng)基中加入以下終濃度的成分：200ng/ml?r-spondin-1,100ng/mlnoggin,50ng/ml?wnt3a,10μm?y27632，1％?n2添加劑，2％?b27添加劑，10mm?hepes，50ng/ml青鏈霉素混合液，50ng/ml人表皮生長(zhǎng)因子。
11、原代類器官中還應(yīng)加入100μg/ml原代抗生素primocin。
12、所述方法(三)或方法(四)中，cyp2g1-rtta/tre?tnf-α小鼠按以下方法構(gòu)建得到：
13、采用crispr/cas9技術(shù)建立cyp2g1基因knockin小鼠，采用crispr/cas9技術(shù)構(gòu)建tigre位點(diǎn)tnf-α基因片段knockin小鼠，兩種基因型小鼠雜交繁育出基因型為cyp2g1-rtta/tre?tnf-α小鼠。
14、本專利技術(shù)還提供上述方法構(gòu)建得到的嗅覺障礙體外模型，包括慢性鼻竇炎體外模型、急性鼻竇炎體外模型、嗅上皮類器官體外炎癥第一模型、嗅上皮類器官體外炎癥第二模型、嗅上皮類器官體外炎癥第三模型。
15、本專利技術(shù)還提供所述嗅覺障礙體外模型在研究嗅覺障礙發(fā)病機(jī)制，鑒定致病基因、制備治療嗅覺障礙藥物中的應(yīng)用。
16、進(jìn)一步，所述慢性鼻竇炎體外模型或急性鼻竇炎體外模型可用于研究基底細(xì)胞增殖對(duì)嗅覺障礙的影響。
17、所述嗅上皮類器官體外炎癥第一模型可用于研究神經(jīng)元細(xì)胞、細(xì)胞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖能力對(duì)嗅覺障礙的影響。
18、所述嗅上皮類器官體外炎癥第二模型可用于研究嗅覺神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)嗅覺障礙的影響。
19、所述嗅上皮類器官體外炎癥第三模型可用于研究嗅上皮類器官中分化出成熟嗅感神經(jīng)元的能力對(duì)嗅覺障礙的影響。
20、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)至少具有如下有益效果：
21、本專利技術(shù)首次提出以嗅上皮類器官本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.基于嗅上皮類器官構(gòu)建的嗅覺障礙體外模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法包括以下之一：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述類器官培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基成分如下：
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法(三)或方法(四)中，Cyp2g1-rtTA/TRE?TNF-α小鼠按以下方法構(gòu)建得到：
4.如權(quán)利要求1所述的方法構(gòu)建得到的嗅覺障礙體外模型，包括慢性鼻竇炎體外模型、急性鼻竇炎體外模型、嗅上皮類器官體外炎癥第一模型、嗅上皮類器官體外炎癥第二模型、嗅上皮類器官體外炎癥第三模型。
5.如權(quán)利要求4所述的嗅覺障礙體外模型在研究嗅覺障礙發(fā)病機(jī)制、鑒定致病基因、制備治療嗅覺障礙藥物中的應(yīng)用。
【技術(shù)特征摘要】
1.基于嗅上皮類器官構(gòu)建的嗅覺障礙體外模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法包括以下之一：
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法中，所述類器官培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基成分如下：
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法(三)或方法(四)中，cyp2g1-rtta/tre?tnf-α小鼠按以下方法構(gòu)...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：余逸群，劉金霞，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
還沒有人留言評(píng)論。發(fā)表了對(duì)其他瀏覽者有用的留言會(huì)獲得科技券。