【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及生物工程，尤其涉及一種用于合成蝦青素的工程菌及其構(gòu)建方法。
技術(shù)介紹
1、蝦青素(3,3′-二羥基-4,4′-二酮基-β,β′-胡蘿卜素)是一種酮式類胡蘿卜素，呈橘紅色，具有脂溶性，不溶于水，可溶于有機(jī)溶劑。蝦青素不僅有較強(qiáng)的著色能力，還具有高效的單線態(tài)氧猝滅能力和抗氧化能力。如蝦青素的抗氧化能力是維生素c的6000倍，已被認(rèn)為是自然界中最強(qiáng)的抗氧化劑。蝦青素可以清除二氧化氮、硫化物、二氧化硫等，也可以有效的抑制自由基引起的脂質(zhì)過氧化作用。除此之外，蝦青素還具有延緩衰老、抑制腫瘤發(fā)生、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、預(yù)防心血管疾病、清除體內(nèi)自由基等生理作用，對紫外線引起的皮膚癌有很好的治療效果。國際上已將其應(yīng)用于保健品、高檔化妝品、醫(yī)藥、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域中。蝦青素由于合成路徑復(fù)雜，價(jià)格昂貴。目前，蝦青素的市場售價(jià)約1000美金/千克，預(yù)計(jì)至2030年，蝦青素的產(chǎn)值可以達(dá)到72.8億元。
2、目前生產(chǎn)蝦青素的方法主要包括化學(xué)合成、自然提取和生物合成。蝦青素廣泛存在于一些海洋動(dòng)物，如螃蟹殼、蝦殼、鮭魚、鱒魚及某些藻類、真菌等生物中。通過在蟹殼、蝦殼等中提取天然蝦青素的傳統(tǒng)方法面臨提取效率低、成本高等瓶頸，已不能滿足市場對蝦青素高的需求量。市場上的蝦青素主要是以化學(xué)合成為主。例如，hoffmann-laroche和basf等公司主要是以化學(xué)合成方法工業(yè)化生產(chǎn)蝦青素。由于蝦青素合成路徑復(fù)雜，化學(xué)合成蝦青素的價(jià)格也非常昂貴，且化學(xué)合成蝦青素的生物學(xué)功能、應(yīng)用效果等與天然蝦青素存在顯著差異。同時(shí)也存在中間體和副產(chǎn)品殘留、安全性低等問
3、目前用于發(fā)酵合成蝦青素的工程菌，常用的微生物包括藻類、酵母、大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌等?？莶菅挎邨U菌作為一種被美國食品和藥物管理局(food?and?drugadministration，fda)認(rèn)證為食品安全微生物，在食品級蝦青素的合成有著重要的意義。然而，現(xiàn)有技術(shù)中尚沒有在枯草芽孢桿菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)蝦青素合成的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術(shù)的目的在于提出一種用于合成蝦青素的工程菌及其構(gòu)建方法，以在枯草芽孢桿菌體內(nèi)實(shí)現(xiàn)蝦青素合成，提高食品級蝦青素的生物合成效率。
2、基于上述目的，本專利技術(shù)提供了一種用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
3、步驟一、敲除枯草芽孢桿菌168基因中的heps基因，構(gòu)建得到△heps菌株bs01；
4、步驟二、敲除bs01基因中的hept基因，得到△heps△hept菌株bs02；
5、步驟三、敲除bs02基因中的mena基因，得到△heps△hept△mena菌株bs03；
6、步驟四、采用融合pcr的方法將湖泊紅球藻crte、crtb、crtw基因同源重組整合到bs03基因組中，得到△heps△hept△mena-crte-crtb-crtw菌株bs04；
7、步驟五、采用融合pcr的方法將谷氨酸棒桿菌crti、crty基因同源重組整合到bs04基因組中，得到△heps△hept△mena-crte-crtb-crtip43-crty-crtw菌株bs05；
8、步驟六、采用融合pcr的方法將約翰遜黃桿菌crtz基因同源重組整合到bs05基因組中，構(gòu)建得到△heps△hept△mena-crte-crtb-crti-crty-crtw-crtz菌株bs06，即所述用于合成蝦青素的工程菌。
9、優(yōu)選的，步驟一中構(gòu)建得到△heps菌株bs01的方法包括如下步驟：
10、a1、以枯草芽孢桿菌168基因組為模板，采用如seq?id?no.1-6所示的引物組擴(kuò)增得到左同源臂、中間片段和右同源臂序列；
11、a2、將獲得的左同源臂、中間片段和右同源臂序列進(jìn)行重疊延伸pcr，得到融合基因片段a；
12、a3、擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，融合基因片段a電轉(zhuǎn)到枯草芽孢桿菌168感受態(tài)細(xì)胞中，即得菌株bs01。
13、優(yōu)選地，步驟二中得到△heps△hept菌株bs02的方法包括如下步驟：
14、b1、以bs01基因組為模板，采用如seq?id?no.7-12所示的引物組擴(kuò)增得到左同源臂、中間片段和右同源臂序列；
15、b2、將獲得的左同源臂、中間片段和右同源臂序列進(jìn)行重疊延伸pcr，得到融合基因片段b；
16、b3、擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，融合基因片段b電轉(zhuǎn)到bs01感受態(tài)細(xì)胞中，即得菌株bs02。
17、優(yōu)選的，步驟三得到△heps△hept△mena菌株bs03的方法包括如下步驟：
18、c1、以bs02基因組為模板，采用如seq?id?no.13-18所示的引物組擴(kuò)增得到左同源臂、中間片段和右同源臂序列；
19、c2、將獲得的左同源臂、中間片段和右同源臂序列進(jìn)行重疊延伸pcr，得到融合基因片段c；
20、c3、擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，融合基因片段c電轉(zhuǎn)到bs02感受態(tài)細(xì)胞中，即得菌株bs02。
21、優(yōu)選的，步驟四得到△heps△hept△mena-crte-crtb-crtw菌株bs04的方法包括如下步驟：
22、d1、以湖泊紅球藻基因組為模板，采用如seq?id?no.19-26所示的引物組擴(kuò)增得到crte-crtb-crtw和中間片段；
23、d2、將獲得的crte-crtb-crtw和中間片段進(jìn)行重疊延伸pcr，得到融合基因片段d；
24、d3、擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，融合基因片段d電轉(zhuǎn)到bs03感受態(tài)細(xì)胞中，即得菌株bs04。
25、優(yōu)選的，步驟五得到△heps△hept△mena-crte-crtb-crtip43-crty-crtw菌株bs05的方法包括如下步驟：
26、e1、以谷氨酸棒桿菌基因組為模板，采用如seq?id?no.27-32所示的引物組擴(kuò)增得到crti-crty和中間片段；
27、e2、將獲得的crti-crty和中間片段進(jìn)行重疊延伸pcr，得到融合基因片段e；
28、e3、擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，融合基因片段e電轉(zhuǎn)到bs04感受態(tài)細(xì)胞中，即得菌株bs05。
29、優(yōu)選的，構(gòu)建得到△heps△hept△mena-crte-crtb-crti-crty-crtw-crtz菌株bs06的方法包括如下步驟：
30、f1、以約翰遜黃桿菌基因組為模板，采用如seq?id?no.33-36所示的引物組擴(kuò)增得到crtz和中間片段；
31、f2、將獲得的crtz和中間片段進(jìn)行重疊延伸pcr，得到融合基因片段f；
32、f3、擴(kuò)增產(chǎn)物純化后，融合基因片段f電轉(zhuǎn)到bs05感受態(tài)細(xì)胞中，即得菌株bs06。...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟一中構(gòu)建得到△hepS菌株BS01的方法包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟二中得到△hepS△hepT菌株BS02的方法包括如下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟三得到△hepS△hepT△menA菌株BS03的方法包括如下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟四得到△hepS△hepT△menA-crtE-crtB-crtW菌株BS04的方法包括如下步驟：
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟五得到△hepS△hepT△menA-crtE-crtB-crtIP43-crtY-crtW菌株BS05的方法包括如下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，構(gòu)建得到△
8.一種用于合成蝦青素的工程菌，其特征在于，采用權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述構(gòu)建方法構(gòu)建得到。
9.根據(jù)權(quán)利要求9所述用于合成蝦青素的工程菌，其特征在于，對用于合成蝦青素的工程菌依次經(jīng)種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)后，得到含有蝦青素的發(fā)酵液。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟一中構(gòu)建得到△heps菌株bs01的方法包括如下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟二中得到△heps△hept菌株bs02的方法包括如下步驟：
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟三得到△heps△hept△mena菌株bs03的方法包括如下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述用于合成蝦青素的工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，步驟四得到△heps△hept△mena-crte-crtb-crtw菌株bs04的方法包括如...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：劉艷，王洲，薛正蓮，唐紅進(jìn)，劉慶濤，趙明，李翔飛，吳傳超，張國強(qiáng)，高旭麗，羅雅妮，郭明雨，陶偉，劉永圓，阿迪克拉·埃爾維斯·夸梅，
申請(專利權(quán))人：安徽工程大學(xué)，
類型：發(fā)明
國別省市：
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