【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專(zhuān)利技術(shù)屬于生物，尤其涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的mirna表達(dá)載體、腺相關(guān)病毒載體及其用途。
技術(shù)介紹
1、腦內(nèi)主要構(gòu)成細(xì)胞為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞。神經(jīng)元(neurons)是神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能單元，負(fù)責(zé)傳遞和處理信息。它們通過(guò)電信號(hào)和化學(xué)信號(hào)與其他神經(jīng)元、肌肉細(xì)胞或腺體細(xì)胞進(jìn)行通信。神經(jīng)元的正常功能對(duì)于整個(gè)神經(jīng)系統(tǒng)的健康和運(yùn)作至關(guān)重要。在許多神經(jīng)退行性疾病(如帕金森病和阿爾茨海默病)中，神經(jīng)元的損傷和死亡是主要病理特征。星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最豐富的膠質(zhì)細(xì)胞，占整個(gè)膠質(zhì)細(xì)胞的20％～40％。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中它們執(zhí)行著廣泛的內(nèi)穩(wěn)態(tài)功能，如參與突觸形成、維持細(xì)胞內(nèi)外離子濃度恒定、參與神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞、形成并維持血腦屏障，為其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐細(xì)胞提供支持等。在病理情況下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可以經(jīng)歷形態(tài)學(xué)和分子變化，以采用所謂的“反應(yīng)性”狀態(tài)，這可以改變它們的功能并改變它們的神經(jīng)支持和神經(jīng)毒性特性之間的平衡。少突膠質(zhì)細(xì)胞(oligodendrocytes)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)中的一種重要的膠質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型。它們的主要功能是生成髓鞘(myelin?sheath)，這一結(jié)構(gòu)包裹在神經(jīng)元的軸突上，起到絕緣作用，能夠顯著提高神經(jīng)沖動(dòng)的傳導(dǎo)速度。小膠質(zhì)細(xì)胞(microglia)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)中的常駐免疫細(xì)胞，具有類(lèi)似于外周免疫系統(tǒng)中巨噬細(xì)胞的功能。它們?cè)诰S持神經(jīng)系統(tǒng)的健康、監(jiān)測(cè)環(huán)境變化和響應(yīng)損傷或感染方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。
2、腺相關(guān)病毒(adeno-associated?virus，aav)，是目
3、目前源自天然或基因工程腺相關(guān)病毒(aav)的基因遞送載體已成為人類(lèi)基因治療的焦點(diǎn)，由于其較低的免疫原性、穩(wěn)定的基因表達(dá)水平和位點(diǎn)特異性整合能力，具有較好的安全性，在基因治療領(lǐng)域的發(fā)展勢(shì)頭日益強(qiáng)勁，越來(lái)越多的臨床試驗(yàn)將其用于各種治療。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，aav是目前用于體內(nèi)遞送轉(zhuǎn)基因至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要載體，其具有高效轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的能力、高度可工程化的細(xì)胞靶向性、低毒性和克服物理屏障(包括血腦屏障)的潛力。目前的神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療領(lǐng)域，我們常常使用特異性啟動(dòng)子的aav特異性感染某種特定類(lèi)型細(xì)胞，以達(dá)到治療疾病的目的。如，使用gfap啟動(dòng)子的aav感染星形膠質(zhì)細(xì)胞，使用synapsin啟動(dòng)子的aav感染神經(jīng)元，使用cd68啟動(dòng)子的aav感染小膠質(zhì)細(xì)胞，使用olig2啟動(dòng)子的aav感染少突膠質(zhì)細(xì)胞。
4、microrna(mirna)是一種內(nèi)源性的微小非編碼rna，長(zhǎng)度一般在20-25個(gè)核苷酸之間，通過(guò)與靶向信使rna在3’未翻譯區(qū)域的堿基配對(duì)來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，廣泛參與了多種關(guān)鍵生物和細(xì)胞過(guò)程，如凋亡、分化、發(fā)育、增殖、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。因此基于mirna的治療方法可能是治療各種疾病的有希望的潛在工具。
5、在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，microrna的重要生理功能和病理功能也逐步被發(fā)現(xiàn)。2017一篇nature研究證實(shí)，下丘腦的神經(jīng)干細(xì)胞通過(guò)外泌體中的microrna控制著機(jī)體的衰老節(jié)奏。其中，最有代表意義的microrna即為mir-124。mir-124的豐度占腦內(nèi)總microrna的25-48％，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)量最高的microrna。mir-124可以促進(jìn)神經(jīng)再生和神經(jīng)發(fā)育，抑制神經(jīng)干細(xì)胞的分化，為中風(fēng)、腦外傷，神經(jīng)退行性疾病等疾病的神經(jīng)修復(fù)提供了備選策略。
6、現(xiàn)有技術(shù)中，多種神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞亞型啟動(dòng)子經(jīng)常用于驅(qū)動(dòng)不同細(xì)胞特異性的靶基因mrna表達(dá)，然而，目前還沒(méi)有特定的啟動(dòng)子可用于控制特定細(xì)胞類(lèi)型中mirna的表達(dá)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)上述的技術(shù)問(wèn)題，本專(zhuān)利技術(shù)的第一方面旨在提供一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性mirna表達(dá)載體，該載體通過(guò)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞內(nèi)，在多西環(huán)素(dox)誘導(dǎo)的情況下，驅(qū)動(dòng)熒光標(biāo)記基因表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)mirna在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)。
2、本專(zhuān)利技術(shù)第二方面提供一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性mirna表達(dá)載體在提高mirna過(guò)表達(dá)中的用途，在多西環(huán)素誘導(dǎo)下，tre啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光標(biāo)記基因表達(dá)，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)mirna特異性表達(dá)。
3、本專(zhuān)利技術(shù)的第三方面提供一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的腺相關(guān)病毒載體，該腺相關(guān)病毒被注射后，利用細(xì)胞特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光基因表達(dá)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)mirna在特定細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá)，可用于追蹤特定細(xì)胞及靶向細(xì)胞治療的優(yōu)勢(shì)。
4、本專(zhuān)利技術(shù)的第四方面提供一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的腺相關(guān)病毒載體在提高mirna的特異性表達(dá)中的用途。
5、本專(zhuān)利技術(shù)的第五方面提供一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的腺相關(guān)病毒載體在制備中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用，例如腦出血、中風(fēng)、腦外傷、神經(jīng)退行性等疾病的神經(jīng)修復(fù)。
6、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本專(zhuān)利技術(shù)的技術(shù)方案為：
7、本專(zhuān)利技術(shù)的第一方面提供了一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的mirna表達(dá)載體，用于構(gòu)建特異性過(guò)表達(dá)的mirna載體，包括：ef1α啟動(dòng)子序列，誘導(dǎo)序列，tre啟動(dòng)子，熒光標(biāo)記基因序列，trna序列，mirna序列，trna序列，sv40?poly(a)終止信號(hào)序列；
8、所述tre啟動(dòng)子序列如seq?id?no.1所示，所述trna序列如seq?id?no.3所示，所述sv40?poly(a)終止信號(hào)序列如seq?id?no.5所示，ef1α啟動(dòng)子序列如seq?id?no.6所示；
9、所述誘導(dǎo)序列為多西環(huán)素誘導(dǎo)激活序列，具體為3g反式激活物蛋白因子，核苷酸序列如seq?id?no.7所示；
10、所述特異性mirna過(guò)表達(dá)基因序列為在多西環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)下游摻入trna-mirna-trna，tre啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光標(biāo)記基因表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)mirna表達(dá)。
11、第一方面方案的優(yōu)選實(shí)施方式，所述mirna為mir-124-3p，序列如seq?id?no.4所示。
12、第一方面方案的優(yōu)選實(shí)施方式，所述熒光標(biāo)記基因序列為tre啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的egfp熒光標(biāo)記基因序列，序列如seq?id?no.2所示。
13、本專(zhuān)利技術(shù)第二方面提供了第一方面所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性mirna表達(dá)載體在特定細(xì)胞(包括但不限于星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元，小膠質(zhì)細(xì)胞等)中提高mirna過(guò)表達(dá)的用途，細(xì)胞特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光標(biāo)記基因表達(dá)，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)mirna特異性表達(dá)。
14、第二方面方案的優(yōu)選實(shí)施方式，所述的mirna特異性表達(dá)是在體內(nèi)本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性miRNA表達(dá)載體，用于構(gòu)建過(guò)表達(dá)miRNA的載體，其特征在于，包括：Ef1α啟動(dòng)子序列，誘導(dǎo)序列，Tre啟動(dòng)子，熒光標(biāo)記序列，tRNA序列，miRNA序列，SV40?poly(A)終止信號(hào)序列；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性miRNA表達(dá)載體，其特征在于，所述miRNA為miR-124-3P，序列如SEQ?ID?NO.4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性miRNA表達(dá)載體，其特征在于，所述熒光標(biāo)記基因序列為多西環(huán)素驅(qū)動(dòng)的EGFP熒光標(biāo)記基因序列，序列如SEQ?ID?NO.2所示。
4.一種如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性miRNA表達(dá)載體在提高miRNA過(guò)表達(dá)中的用途，其特征在于，多西環(huán)素誘導(dǎo)下，Tre啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光標(biāo)記基因表達(dá)，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)miRNA特異性表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miRNA特異性表達(dá)是在體外特異性表達(dá)。
6.一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性miRNA過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒載體，其特征在于，包括：細(xì)胞特
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的miRNA過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒載體，其特征在于，所述miRNA序列為miR-124-3P，序列如SEQ?ID?NO.4所示。
8.一種如權(quán)利要求6或7所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的miRNA過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒載體在制備轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)動(dòng)物模型中的用途。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于，所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的miRNA表達(dá)載體為在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的miRNA表達(dá)；
10.一種如權(quán)利要求6所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性的miRNA過(guò)表達(dá)腺相關(guān)病毒載體在制備中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)炎癥相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性mirna表達(dá)載體，用于構(gòu)建過(guò)表達(dá)mirna的載體，其特征在于，包括：ef1α啟動(dòng)子序列，誘導(dǎo)序列，tre啟動(dòng)子，熒光標(biāo)記序列，trna序列，mirna序列，sv40?poly(a)終止信號(hào)序列；
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性mirna表達(dá)載體，其特征在于，所述mirna為mir-124-3p，序列如seq?id?no.4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性mirna表達(dá)載體，其特征在于，所述熒光標(biāo)記基因序列為多西環(huán)素驅(qū)動(dòng)的egfp熒光標(biāo)記基因序列，序列如seq?id?no.2所示。
4.一種如權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞特異性mirna表達(dá)載體在提高mirna過(guò)表達(dá)中的用途，其特征在于，多西環(huán)素誘導(dǎo)下，tre啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光標(biāo)記基因表達(dá)，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)mirna特異性表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于，所述的mirna特異性表達(dá)是...
【專(zhuān)利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：李天文，朱劍虹，王鵬，
申請(qǐng)(專(zhuān)利權(quán))人：復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院，
類(lèi)型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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