【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種發酵生產nmn的重組大腸桿菌及其應用，屬于基因工程及生物工程。
技術介紹
1、nad+是近年來最受關注的抗衰老小分子之一，而外源攝取β-煙酰胺單核苷酸(β-nicotinamide?mononucleotide，β-nmn，以下簡稱nmn)是補充nad+十分直接且有效的手段。而nmn作為一種結構復雜的同分異構體，其化學合成的方法是復雜且艱巨的，所以目前nmn主要通過生物法合成。目前生物法合成nmn主要包括酶法和發酵法兩個方法。
2、nmn的化學法合成主要以煙酰胺與四乙酰核糖為起始原料，經三氟甲磺酸三甲基硅酯(tmsotf)縮合、脫乙酰基，再經三氯氧磷/磷酸三甲酯磷酸化制得β-nmn；或通過將縮酮化保護的煙酰胺核糖磷酸化、脫保護制備β-nmn。化學合成方法nmn技術相較而言更加完備，但是存在著諸多缺陷，一方面環境不友好，多種原料具有毒性；另一方面經濟不友好，部分原料價格昂貴，所以nmn的化學法合成成本居高不下。
3、nmn的酶法合成主要分為兩大類型：一種是nr為核心底物，加入atp后通過煙酰胺核糖激酶的催化形成β-nmn；另一種是以磷酸核糖-1-焦磷酸為核心底物，在引入atp和nam后通過煙酰胺磷酸核糖轉移酶的催化形成β-nmn。酶法合成轉化率較高，但底物成本仍然較高，不利于工業化生產。
4、nmn的發酵法生產主要是以nam和葡萄糖或是其他能夠生產prpp的糖類為底物，通過代謝工程菌株直接生產nmn。發酵法合成轉化率高，且成本低廉。
技術實現思路b>
1、本申請旨在構建更利于nmn積累的重組菌株，在已構建的底盤菌株的基礎上，表達合成nmn的酶基因，表達prpp合成相關的酶基因，并敲除不利于prpp積累的酶基因，優化發酵過程，提高nmn的產量。
2、本專利技術提供了一株具有煙酰胺單核苷酸合成能力的基因工程菌，表達了煙酰胺磷酸核糖基轉移酶(nampt酶)、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(prpp合酶)、轉運蛋白bmpnuc、葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(zwf)、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(gnd)、果糖-1,6-二磷酸酶ii(glpx)、玻璃體血紅蛋白酶(vhb)和nadh轉氫酶(stha)。
3、在一種實施方式中，所述煙酰胺磷酸核糖基轉移酶(nampt)的氨基酸序列與序列seq?id?no.1具有至少95％的一致性；所述5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶(prpp合酶)的氨基酸序列與序列seq?id?no.2具有至少95％的一致性；所述轉運蛋白bmpnuc的氨基酸序列與序列seq?id?no.3具有至少95％的一致性；所述葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(zwf)的氨基酸序列與序列seq?id?no.4具有至少95％的一致性；所述6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(gnd)的氨基酸序列與序列seq?id?no.5具有至少95％的一致性；所述果糖-1,6-二磷酸酶ii(glpx)的氨基酸序列與序列seq?id?no.6具有至少95％的一致性；所述玻璃體血紅蛋白酶(vhb)的氨基酸序列與序列seq?id?no.7具有至少95％的一致性；所述nadh轉氫酶(stha)的氨基酸序列與序列seq?id?no.8具有至少95％的一致性。
4、在一種實施方式中，所述煙酰胺磷酸核糖基轉移酶來源于松樹噬幾丁質菌(chitinophaga?pinensis)含有seq?id?no.1所示的氨基酸序列；所述prpp合酶來源于解淀粉芽孢桿菌(bacillus?amyloliquefaciens)，含有如seq?id?no.2所示的氨基酸序列；所述轉運蛋白bmpnuc來源于類霉菌芽孢桿菌(bacillus?mycoides)，含有seq?id?no.3所示的氨基酸序列；所述葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶(zwf)來源于大腸桿菌(escherichia?coli)，含有seq?id?no.4所示的氨基酸序列；所述6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(gnd)來源于大腸桿菌(escherichia?coli)，含有seq?id?no.5所示的氨基酸序列；所述果糖-1,6-二磷酸酶ii(glpx)來源于大腸桿菌(escherichia?coli)，含有seq?id?no.6所示的氨基酸序列；所述玻璃體血紅蛋白酶(vhb)來源于透明顫菌(vitreoscilla)，含有seq?id?no.7所示的氨基酸序列；所述nadh轉氫酶(stha)來源于大腸桿菌(escherichia?coli)，含有seq?id?no.8所示的氨基酸序列。
5、在一種實施方式中，編碼所述煙酰胺磷酸核糖基轉移酶的基因nampt具有seq?idno.9所示的核苷酸序列；編碼所述prpp合酶的基因prs具有seq?id?no.10所示的核苷酸序列；編碼所述轉運蛋白的基因pnuc具有seq?id?no.11所示的核苷酸序列；編碼所述葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶的基因zwf具有seq?id?no.12所示的核苷酸序列；編碼所述6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的基因gnd具有seq?id?no.13所示的核苷酸序列；編碼所述果糖-1,6-二磷酸酶ii的基因glpx具有seq?id?no.14所示的核苷酸序列；編碼所述玻璃體血紅蛋白酶的基因vhb具有seq?id?no.15所示的核苷酸序列；編碼所述nadh轉氫酶的基因stha具有seq?id?no.16所示的核苷酸序列。
6、在一種實施方式中，所述基因工程菌的底盤菌株包括但不限于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、釀酒酵母、畢赤酵母菌等適合構建表達系統的微生物菌株。
7、在一種實施方式中，所述枯草芽孢桿菌包括但不限于b.subtilis?168或b.subtilis?ws9。
8、在一種實施方式中，所述大腸桿菌包括但不限于e.coli?bl21(de3)、e.coli?bl21star(de3)、e.coli?bl21(de3)plyss、e.coli?rosetta(de3)或e.coli?jm109(de3)。
9、在一種實施方式中，構建基因工程菌株時使用的過表達載體質粒包括但不限于prsfduet-1、petduet-1、pcdfduet-1、pma5、pwb980、pht43、pht01和pet-22b(+)、pet-28a(+)、pet-30a(+)、puc57等適用于構建過表達基因工程菌株的其他載體質粒。
10、在一種實施方式中，所述轉運蛋白bmpnuc以質粒pacycduet-1或pcdfduet-1為表達載體。
11、在一種實施方式中，所述煙酰胺磷酸核糖基轉移酶nampt和prpp合酶以prsfduet-1或petduet-1為表達載體。
12、在一種實施方式中，所述葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、果糖-1,6-二磷酸酶ii和玻璃體血紅蛋白酶以pet-28a(+)或prsfduet-1為表達載體。
13、在一種實施方式中，所述基因工程菌的底盤菌株為大腸桿菌，所述大腸桿菌敲除了pnc本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種具有煙酰胺單核苷酸合成能力的重組大腸桿菌，其特征在于，表達煙酰胺磷酸核糖基轉移酶、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶、轉運蛋白BMpnuC、葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、果糖-1,6-二磷酸酶II、玻璃體血紅蛋白酶和NADH轉氫酶。
2.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，還敲除了pncC、ushA、nadR、purR、pncA、edd、pfkA、pntAB中的一個或多個基因。
3.根據權利要求1或2所述的重組大腸桿菌，其特征在于，以pETDuet-1為載體表達PRPP合酶和基因煙酰胺磷酸核糖基轉移酶，和/或以pCDFDuet-1為載體表達轉運蛋白BMpnuC，和/或以pRSFDuet-1為載體表達葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶、果糖-1,6-二磷酸酶II、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和玻璃體血紅蛋白酶。
4.根據權利要求1～3任一所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述煙酰胺磷酸核糖基轉移酶含有SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列；所述5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶含有如SEQID?NO.2所示的氨基酸序列；所述轉運蛋
5.含有權利要求1～4任一所述重組大腸桿菌的發酵劑。
6.一種促進重組大腸桿菌合成NMN的方法，其特征在于，在大腸桿菌中過表達如SEQ?IDNO.1所示的煙酰胺磷酸核糖基轉移酶，如SEQ?ID?NO.2所示的5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶，如SEQ?ID?NO.3所示NMN轉運蛋白，如SEQ?ID?NO.4所示葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶，如SEQID?NO.5所示6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，如SEQ?ID?NO.6所示果糖-1,6-二磷酸酶II，如SEQ?IDNo.7所示的玻璃體血紅蛋白酶Vhb和如SEQ?ID?No.8所示的NADH轉氫酶EcSthA。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，還敲除大腸桿菌的pncC、ushA、nadR、purR、pncA、edd、pfkA、pntAB基因。
8.一種發酵生產NMN的方法，其特征在于，將權利要求1～4任一所述的重組大腸桿菌在35～42℃培養至OD600＝3～4，用誘導劑誘導NMN的合成；
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，發酵過程中還補加葡萄糖。
10.權利要求1～4任一所述的重組大腸桿菌工程，或權利要求5所述的發酵劑，或權利要求6～9任一所述的方法在食品、藥品、化妝品、飼料、紡織品領域制備含NMN的產品中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種具有煙酰胺單核苷酸合成能力的重組大腸桿菌，其特征在于，表達煙酰胺磷酸核糖基轉移酶、5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶、轉運蛋白bmpnuc、葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶、果糖-1,6-二磷酸酶ii、玻璃體血紅蛋白酶和nadh轉氫酶。
2.根據權利要求1所述的重組大腸桿菌，其特征在于，還敲除了pncc、usha、nadr、purr、pnca、edd、pfka、pntab中的一個或多個基因。
3.根據權利要求1或2所述的重組大腸桿菌，其特征在于，以petduet-1為載體表達prpp合酶和基因煙酰胺磷酸核糖基轉移酶，和/或以pcdfduet-1為載體表達轉運蛋白bmpnuc，和/或以prsfduet-1為載體表達葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶、果糖-1,6-二磷酸酶ii、6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶和玻璃體血紅蛋白酶。
4.根據權利要求1～3任一所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述煙酰胺磷酸核糖基轉移酶含有seq?id?no.1所示的氨基酸序列；所述5-磷酸核糖-1-焦磷酸合成酶含有如seqid?no.2所示的氨基酸序列；所述轉運蛋白含有seq?id?no.3所示的氨基酸序列；所述葡萄糖-6-磷酸1-脫氫酶含有seq?id?no.4所示的氨基酸序列；所述6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶含有如seq?id?no.5所示的氨基酸序列；所述果糖-1,6-二磷酸酶ii含有如seq?id?no.6所示的氨基酸序列；所述玻璃體血紅蛋...
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