【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統及應用，屬于分子生物學、生物技術、基因工程。
技術介紹
1、蛋白質的相互作用是研究蛋白質生物學功能、信號通路網絡的重要環節。雙分子熒光互補（bimolecular?fluorescence?complementation,?bifc）實驗是利用熒光蛋白的發光特性來檢測蛋白質相互作用的常用和強力手段，可直接、快速地判斷蛋白質相互作用的情況及亞細胞定位。通過融合熒光蛋白報告基因的表達來判斷目標蛋白的亞細胞定位情況也是目前應用最廣泛的一種方法。雙分子熒光互補實驗原理是將熒光蛋白（如eyfp）分割成n端和c端并組成相應的完整表達盒，分別與待檢測蛋白連接后，將重組載體共轉染煙草葉肉細胞等，若兩蛋白能夠相互作用，會使熒光蛋白的n端片段與c端相互靠近，從而使熒光蛋白重新發出熒光。若兩蛋白間沒有相互作用，則不能激發產生熒光。開展雙分子熒光互補實驗通常需要細胞核等定位的marker，一般主要利用定位在細胞核的對照空載體或利用熒光染料dapi能夠與dna強結合的特性來指示細胞核的位置，但這兩種方式均具有一定的局限性。前者需要共轉染額外的包含核定位對照載體的農桿菌，后者因dapi是一種可以穿透生物膜的高毒致癌物質，使雙分子熒光互補實驗操作過程具有危害性。因此，有必要提供一種低成本、安全便捷的開展雙分子熒光互補實驗的方法。
技術實現思路
1、本專利技術所要解決的技術問題是，克服現有技術的不足而提供一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統及應用，
2、本專利技術提供一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，包括pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體，所述pbifc-nls-dsred2-enc載體包含能特異性指示細胞核定位的紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2和不能單獨產生熒光的neyfp表達盒dna分子；
3、所述紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2是由superpromoter啟動子序列、cor47-5′utr序列、細胞核定位信號nls序列、紅色熒光蛋白dsred2編碼區序列和終止子hsp-t878序列依次順序連接組成的表達盒；
4、所述neyfp表達盒dna分子是由2?×?camv?35s啟動子序列、translationalenhancer序列、nc?frame序列、neyfp編碼區序列和camv?35s?terminator序列依次順序連接組成的表達盒；
5、所述pbifc-ecc載體包含不能單獨產生熒光的ceyfp表達盒dna分子，所述ceyfp表達盒dna分子是由2?×?camv?35s啟動子序列、translational?enhancer序列、nc?frame序列、ceyfp編碼區序列和camv?35s?terminator序列依次順序連接組成的表達盒。
6、本專利技術利用能特異性指示細胞核定位的nls-dsred2融合蛋白、啟動活性更強的superpromoter、翻譯起始增強子cor47-5′utr和可顯著增加基因表達量的hsp-t878終止子對檢驗植物蛋白相互作用的bifc表達載體進行改進。本專利技術的雙分子熒光互補系統pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體整合有表達增強的nls-dsred2熒光蛋白，通過分別與相互作用的一組蛋白融合后，在不同激發光下能夠分別發出清晰且穩定的紅色dsred2熒光信號和綠色yfp熒光信號，且不存在信號交叉干擾，紅色熒光信號能夠準確、特異定位在細胞核中，而yfp熒光信號可檢測兩個蛋白相互作用的定位情況。
7、本專利技術提供用于檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，包括pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體。研究發現，細胞核定位信號nls能夠穩定且特異地將蛋白質定位到細胞核中。因此，利用更強的superpromoter啟動子、翻譯起始增強子cor47-5′utr和可顯著增加基因表達量的hsp-t878終止子以增強熒光蛋白信號，并通過細胞核定位信號nls將熒光蛋白dsred2特異性定位于細胞核，且dsred2表達盒串聯共表達于pbifc-enc載體中。兩個載體中的neyfp和ceyfp可通過分別與相互作用的蛋白融合后被靠近而重新產生yfp熒光，能夠實現自帶核定位標記的植物蛋白相互作用檢測表達載體的創新性開發和應用。通過將相互作用的蛋白編碼基因片段分別克隆到pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體中，即可在激光共聚焦/熒光顯微鏡下利用特異性定位在細胞核中的紅色熒光信號作為核定位marker，根據yfp熒光信號檢測兩個蛋白的相互作用及亞細胞定位情況，無需接觸高毒致癌的dna熒光染料dapi，同時避免了需額外使用核定位對照載體。
8、作為本專利技術進一步優化的技術方案如下：
9、上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，所述紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2產生紅色熒光并用于特異性指示細胞核定位，所述neyfp表達盒、ceyfp表達盒dna分子分別與一個待檢測蛋白融合之后通過兩個待檢測蛋白的相互作用被拉近從而產生yfp熒光，通過激光共聚焦/熒光顯微鏡檢測紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的表達情況。兩種熒光成像效果清晰、穩定，且相互獨立。因此，利用此系統可進行便捷、低廉和安全的植物雙分子熒光互補實驗操作。
10、上述neyfp表達盒和ceyfp表達盒可通過分別與相互作用的蛋白融合后被靠近從而重新產生綠色yfp熒光，紅色dsred2熒光和綠色yfp熒光可通過激光共聚焦/熒光顯微鏡分別檢測到兩個相互獨立的熒光蛋白信號。
11、上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，所述紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2具有如seq?no.?1中第1-2928?nt所示的核苷酸序列，所述neyfp表達盒dna分子具有如seq?no.?2中第1-2315?nt所示的核苷酸序列，所述ceyfp表達盒dna分子具有如seqno.?3中第1-1988?nt所示的核苷酸序列。
12、上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統中包含的pbifc-nls-dsred2-enc載體質粒和pbifc-ecc載體質粒及其構建方法。
13、上述pbifc-nls-dsred2-enc載體質粒含有同向串聯特異性指示細胞核定位的紅色熒光蛋白nls-dsred2表達盒和不能單獨產生熒光的neyfp表達盒基因編碼序列，所述pbifc-ecc載體含有不能單獨產生熒光的ceyfp表達盒基因編碼序列。
14、含有上述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統中pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體的重組表達載體、重組菌、轉基因細本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，其特征在于：包括pBiFC-NLS-DsRED2-Enc載體和pBiFC-Ecc載體，所述pBiFC-NLS-DsRED2-Enc載體包含紅色熒光蛋白表達盒NLS-DsRed2和nEYFP表達盒DNA分子；
2.根據權利要求1所述一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，其特征在于：所述紅色熒光蛋白表達盒NLS-DsRed2產生紅色熒光并用于特異性指示細胞核定位，所述nEYFP表達盒、cEYFP表達盒DNA分子分別與一個待檢測蛋白融合之后通過兩個待檢測蛋白的相互作用被拉近從而產生YFP熒光，通過激光共聚焦/熒光顯微鏡檢測紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的表達情況。
3.根據權利要求1所述一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，其特征在于：所述紅色熒光蛋白表達盒NLS-DsRed2具有如SEQ?NO.?1中第1-2928?nt所示的核苷酸序列，所述nEYFP表達盒DNA分子具有如SEQ?NO.?2中第1-2315?nt所示的核苷酸序列，所述cEYFP表達盒DNA分子具有如SEQ?NO.?3中第1-1988
4.權利要求1或2或3所述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統中包含的pBiFC-NLS-DsRED2-Enc載體質粒和pBiFC-Ecc載體質粒及其構建方法。
5.根據權利要求4所述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統中包含的pBiFC-NLS-DsRED2-Enc載體和pBiFC-Ecc載體，其特征在于：所述pBiFC-NLS-DsRED2-Enc載體質粒含有同向串聯特異性指示細胞核定位的紅色熒光蛋白NLS-DsRed2表達盒和不能單獨產生熒光的nEYFP表達盒基因編碼序列，所述pBiFC-Ecc載體含有不能單獨產生熒光的cEYFP表達盒基因編碼序列。
6.含有權利要求5所述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統中pBiFC-NLS-DsRED2-Enc和pBiFC-Ecc的重組表達載體、重組菌、轉基因細胞或表達盒。
7.如權利要求6所述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統中pBiFC-NLS-DsRED2-Enc和pBiFC-Ecc重組表達載體的DNA分子，以及含有所述DNA分子、重組報告基因表達載體的轉基因重組菌或細胞。
8.如權利要求1至5任一項所述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統的應用，其特征在于：所述系統用于檢測植物蛋白相互作用。
9.根據權利要求8所述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統的應用，其特征在于：當含有雙分子熒光互補系統中分別融合目的蛋白編碼基因重組表達載體的農桿菌共同瞬時轉化煙草葉肉細胞后，通過激光共聚焦/熒光顯微鏡可觀察到不發熒光的兩個表達盒被拉近而產生YFP熒光，且NLS-DsRed2表達盒同時產生能特異性指示細胞核定位的紅色熒光。
10.根據權利要求9所述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統的應用，其特征在于，通過激光共聚焦/熒光顯微鏡觀察分別與一組目標蛋白編碼基因融合的pBiFC-NLS-DsRED2-Enc和pBiFC-Ecc重組表達載體的農桿菌瞬時轉化煙草葉肉細胞后的熒光信號，根據定位于細胞核中的紅色熒光信號作為核定位Marker，并根據YFP熒光信號的產生及位置判斷植物蛋白質的相互作用情況，具體包括：
...【技術特征摘要】
1.一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，其特征在于：包括pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體，所述pbifc-nls-dsred2-enc載體包含紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2和neyfp表達盒dna分子；
2.根據權利要求1所述一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，其特征在于：所述紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2產生紅色熒光并用于特異性指示細胞核定位，所述neyfp表達盒、ceyfp表達盒dna分子分別與一個待檢測蛋白融合之后通過兩個待檢測蛋白的相互作用被拉近從而產生yfp熒光，通過激光共聚焦/熒光顯微鏡檢測紅色熒光蛋白和綠色熒光蛋白的表達情況。
3.根據權利要求1所述一種檢驗植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統，其特征在于：所述紅色熒光蛋白表達盒nls-dsred2具有如seq?no.?1中第1-2928?nt所示的核苷酸序列，所述neyfp表達盒dna分子具有如seq?no.?2中第1-2315?nt所示的核苷酸序列，所述ceyfp表達盒dna分子具有如seq?no.?3中第1-1988?nt所示的核苷酸序列。
4.權利要求1或2或3所述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統中包含的pbifc-nls-dsred2-enc載體質粒和pbifc-ecc載體質粒及其構建方法。
5.根據權利要求4所述檢測植物蛋白相互作用的雙分子熒光互補系統中包含的pbifc-nls-dsred2-enc載體和pbifc-ecc載體，其特征在于：所述pbifc-nls-dsred2-enc載體質粒含有同向串聯特異性指示細胞核定位的紅色熒...
【專利技術屬性】
技術研發人員：朱明庫，王藝霏，孟小慶，呂雨蒙，劉維威，劉思媛，于婧，洪海婷，董婷婷，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：
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