【技術實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術涉及病原微生物檢測領域，尤其涉及一種牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒的maldi-tof質(zhì)譜檢測方法，及方法所使用的引物組合。
技術介紹
1、牛結節(jié)性皮膚病病毒(lumpy?skin?disease?virus，lsdv)、山羊痘病毒(goatpoxvirus，gtpv)和綿羊痘病毒(sheeppox?virus，sppv)同為羊痘病毒屬(capripoxvirus，capv)成員，該屬病毒感染后可造成發(fā)熱、皮膚或黏膜結節(jié)(或丘疹)、淋巴結腫大等癥狀。痘病毒屬病毒導致的疾病會顯著降低生產(chǎn)性能，發(fā)病嚴重的動物還可導致死亡。例如牛結節(jié)性皮膚病可造成感染牛皮膚深洞致皮張無法利用，公畜不育、母畜流產(chǎn)，奶牛產(chǎn)奶量顯著下降，嚴重時死亡。而山羊痘、綿羊痘病毒感染極其易感羊品種時死亡率可高達100％，三種疫病流行在世界范圍內(nèi)已造成巨大經(jīng)濟損失。由于牛、綿羊和山羊養(yǎng)殖業(yè)的經(jīng)濟重要性及病毒的潛在快速跨境傳播，牛結節(jié)性皮膚病、山羊痘和綿羊痘均列為世界動物衛(wèi)生組織(oie)法定報告疾病。
2、目前，針對牛結節(jié)性皮膚病、山羊痘和綿羊痘的鑒別診斷，通常采用經(jīng)典的病毒學分離技術與血清學分析策略。病毒分離技術核心在于采集疑似病變組織樣本，通過細胞培養(yǎng)體系進行病毒增殖，隨后運用電子顯微鏡技術精細解析培養(yǎng)所得病毒粒子的形態(tài)與結構特征。盡管此策略能精準實現(xiàn)病毒的種類鑒定與亞型劃分，但其顯著缺陷在于耗時冗長(常需數(shù)日至數(shù)周)，操作流程繁復，對實驗人員的專業(yè)技能要求嚴苛，從而制約了其在臨床實踐與大規(guī)模篩查中的普及與應用。由于lsdv、gt
3、因此，亟需開發(fā)一種特異性高、靈敏度高、高通量且操作相對簡單的低成本檢測方法，對牛結節(jié)性皮膚病、山羊痘和綿羊痘病毒進行檢測鑒定與進一步分型。
技術實現(xiàn)思路
1、有鑒于此，本專利技術將多重pcr擴增技術、雙基因靶標策略、單堿基延伸反應，以及基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(maldi-tof?ms)的高精度分析能力相結合，旨在開發(fā)一種能夠同時對三種羊痘病毒進行多靶標精準檢測的高效方法。具體而言，本專利技術設計并應用了2對特異性擴增引物以靶向擴增目的基因片段，并輔以2條延伸引物用于后續(xù)的單堿基延伸反應，并且通過精確測量延伸產(chǎn)物中單一堿基在maldi-tof?ms上產(chǎn)生的分子量差異，能夠?qū)崿F(xiàn)在單管反應體系中，不僅高效地鑒別出樣本中是否存在三種羊痘病毒(即lsdv、gtpv和sppv)的感染，同時能進一步細分并明確報告具體感染的是這三種病毒中的一種、幾種或全部，從而極大地提升了檢測的全面性、特異性和準確性。
2、本專利技術的技術方案是這樣實現(xiàn)的：
3、第一方面，本專利技術提供了一種鑒定牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒的引物組合物，所述組合物包括擴增引物和單堿基延伸引物，所述擴增引物包括seq?idno:1-4，所述單堿基延伸引物包括seq?id?no:5-6。
4、雙基因靶標的選擇和引物設計思路包括如下：
5、p32蛋白是位于山羊痘病毒膜表面的一種主要結構蛋白，是羊痘病毒屬特有的蛋白，編碼該蛋白的基因具有羊痘病毒屬的特異性。gpcr(g蛋白偶聯(lián)趨化因子受體)基因在羊痘病毒屬中具有一定的保守性，但同時也存在足夠的序列差異，以用于區(qū)分不同的病毒種類。根據(jù)已選定靶標基因的保守序列，設計特異性擴增引物，在每條擴增引物的5’端加上10個堿基的通用序列acgttggatg，在擴增區(qū)中的保守序列區(qū)設計一條單堿基延伸引物，在單堿基延伸引物的3’末端，允許延伸一個經(jīng)設計確定的堿基，作為不同羊痘病毒的特異性序列標記。gpcr基因延伸堿基位點選擇如圖1所示，從3種痘病毒的代表毒株的序列比對結果可知，當延伸引物設計在突變堿基前的位置時，山羊痘病毒延伸堿基為t，綿羊痘病毒的延伸堿基為a，牛結節(jié)性皮膚病病毒的延伸堿基為g。
6、第二方面，本專利技術提供了所述引物組合物的應用，所述應用為非疾病治療和/或診斷，所述引物組合物用于(a1)-(a2)中的至少一種用途：(a1)制備牛結節(jié)性皮膚病、山羊痘和/或綿羊痘診斷產(chǎn)品；(a2)制備牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒的檢測產(chǎn)品。
7、第三方面，本專利技術提供了一種試劑盒，所述試劑盒包括所述的引物組合物。
8、進一步地，所述試劑盒還包括pcr擴增反應試劑。在一些實施例中，所述pcr擴增反應試劑盒的組分包括：mg2+、dntps、h2o、dna聚合酶和緩沖液中的一種或多種的組合。
9、所述試劑盒還包括去磷酸反應試劑。在一些實施例中，所述去磷酸反應試劑的組分包括：堿性磷酸酶和緩沖液。進一步地，所述堿性磷酸酶為蝦堿性磷酸酶(sap酶)。
10、所述試劑盒還包括單堿基延伸反應試劑。在一些實施例中，所述單堿基延伸反應試劑的組分包括：dntps、dna聚合酶、h2o、緩沖液和mg2+中的一種或多種的組合。
11、第四方面，本專利技術提供了一種牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒的maldi-tof質(zhì)譜檢測方法，所述檢測方法為非疾病治療和/或診斷，以p32基因的保守區(qū)域以及gpcr基因的變異區(qū)域作為雙靶點進行檢測，包括如下步驟：
12、(s1)以seq?id?no:1-4為擴增引物，對待測樣本進行pcr擴增反應，獲得擴增產(chǎn)物；
13、(s2)將所述擴增產(chǎn)物利用堿性磷酸酶進行去磷酸化處理，獲得去磷酸產(chǎn)物；
14、(s3)以seq?id?no:5-6為單堿基延伸引物，對所述去磷酸產(chǎn)物進行單堿基延伸，獲得延伸產(chǎn)物；
15、(s4)將所述延伸產(chǎn)物進行純化；
16、(s5)maldi-tof質(zhì)譜檢測。
17、所述待測樣本為所提取的核酸。具體地，所述步驟(s4)中，所述純化包括柱層析純化、page純化、磁珠純化和hplc純化中的一種。所述柱層析純化包括樹脂脫鹽純化。
18、在一些優(yōu)選的實施例中，所述步驟(s1)中，pcr擴增反應為多重pcr擴增反應，其反應程序包括：95℃預變性5min；95℃變性15s，60℃退火與延伸30s，45個循環(huán)；4℃保存。
19、在一些優(yōu)選的實施例中，所述步驟(s3)中，單堿基延伸的反應程序包括(見表6)：95℃預變性30s；95℃變性5s，(52℃本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術保護點】
1.一種鑒定牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒的引物組合物，其特征在于，所述組合物包括擴增引物和單堿基延伸引物，所述擴增引物包括SEQ?ID?NO:1-4，所述單堿基延伸引物包括SEQ?ID?NO:5-6。
2.根據(jù)權利要求1所述的引物組合物的應用，其特征在于，所述應用為非疾病治療和/或診斷，所述引物組合物用于(A1)-(A2)中的至少一種用途：(A1)制備牛結節(jié)性皮膚病、山羊痘和/或綿羊痘診斷產(chǎn)品；(A2)制備牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒的檢測產(chǎn)品。
3.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物組合物。
4.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，所述試劑盒還包括PCR擴增反應試劑。
5.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，所述試劑盒還包括去磷酸反應試劑。
6.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，所述試劑盒還包括單堿基延伸反應試劑。
7.一種牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒的MALDI-TOF質(zhì)譜檢測方法，其特征在于，所述檢測方法為非疾病治療和/或診斷，以P32基因的保守區(qū)域以及GPC
8.根據(jù)權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(S1)中，PCR擴增反應為多重PCR擴增反應，其反應程序包括：95℃預變性5min；95℃變性15s，60℃退火與延伸30s，45個循環(huán)；4℃保存。
9.根據(jù)權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(S3)中，單堿基延伸的反應程序包括：95℃預變性30s；95℃變性5s，52℃退火5s，80℃延伸5s，40個循環(huán)；其中退火延伸單獨做5個循環(huán)；72℃再延伸3min，4℃保存。
10.根據(jù)權利要求7所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(S5)中，MALDI-TOF質(zhì)譜檢測步驟(S4)所獲得的純化產(chǎn)物的分子量，根據(jù)分子量差異鑒定牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒。
...【技術特征摘要】
1.一種鑒定牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒的引物組合物，其特征在于，所述組合物包括擴增引物和單堿基延伸引物，所述擴增引物包括seq?id?no:1-4，所述單堿基延伸引物包括seq?id?no:5-6。
2.根據(jù)權利要求1所述的引物組合物的應用，其特征在于，所述應用為非疾病治療和/或診斷，所述引物組合物用于(a1)-(a2)中的至少一種用途：(a1)制備牛結節(jié)性皮膚病、山羊痘和/或綿羊痘診斷產(chǎn)品；(a2)制備牛結節(jié)性皮膚病病毒、山羊痘病毒和綿羊痘病毒的檢測產(chǎn)品。
3.一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權利要求1所述的引物組合物。
4.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，所述試劑盒還包括pcr擴增反應試劑。
5.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，所述試劑盒還包括去磷酸反應試劑。
6.根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，所述試劑盒還包括單堿基延伸反應試劑。
7.一種牛結節(jié)性皮膚病病毒、...
【專利技術屬性】
技術研發(fā)人員：任彤，郭悠然，趙相鵬，郭惠民，高志強，宋士琦，史喜菊，張穎，汪琳，
申請(專利權)人：中國海關科學技術研究中心，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。