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    上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法技術

    技術編號:43886002 閱讀:4 留言:0更新日期:2025-01-03 13:02
    本發明專利技術提供上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,屬于響應蛋白檢測技術領域,所述方法包括如下步驟:構建上頜前牙內收實驗動物模型標本,骨皮質結構及密度變化,骨形態計量學分析,成骨及凋亡相關標志物檢測,染色檢測凋亡細胞,分析上頜前牙內收過程中腭側骨皮質骨陷窩?骨小管系統的變化,體外培養骨細胞在流體剪切力下的力學響應,篩選體外培養骨細胞力學響應關鍵蛋白A,分析關鍵蛋白A在體外流體剪切力培養的骨細胞調控成骨細胞或破骨細胞功能的作用機制。本發明專利技術力負荷引起組織液在骨陷窩?骨小管系統內流動是骨細胞識別信號的形式,骨內液體流動下骨細胞的生物學調控機制,將促進人們對正畸力致骨皮質重塑過程的深入理解。

    【技術實現步驟摘要】

    本專利技術涉及響應蛋白檢測,尤其涉及上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法


    技術介紹

    1、骨性ⅱ類錯畸形是正畸臨床常見的顱面畸形,主要表現為明顯的上頜前突和(或)下頜后縮,對面部美觀破壞較大,可影響患者心理健康甚至正常社交。通過正畸-正頜聯合治療,或牙齒代償性移動進行正畸掩飾性治療是矯治畸形的常用手段。由于存在一定的手術、麻醉風險,以及治療周期長、費用高昂等原因,許多患者無法接受手術治療改善畸形。近年來,隨著種植體支抗在正畸診療中的廣泛應用,正畸醫生移動牙齒的能力有了質的變化,如利用絕對支抗內收前牙,在一定程度上拓寬了正畸臨床適用范圍。但同時,因牙齒內收距離長或前牙區牙槽骨厚度先天不足的限制,前牙內收后有發生腭側骨組織骨開窗、骨開裂或牙根吸收風險。因此,是否可增加前牙區腭側牙槽骨的厚度,或是否可引發腭側牙槽骨的重塑,擴大前牙內收的安全范圍,是骨性ⅱ類錯畸形正畸代償治療的關鍵及難點。因此,需要設計一種上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,使得上頜腭側骨皮質重塑能夠成為現實。


    技術實現思路

    1、本專利技術的目的在于提供上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,解決現有無法實現上頜腭側骨皮質重塑的技術問題。

    2、為了實現上述目的,本專利技術采用的技術方案如下:

    3、上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,所述方法包括如下步驟:

    4、步驟1:構建上頜前牙內收實驗動物模型標本;

    5、步驟2:骨皮質結構及密度變化;

    6、步驟3:骨形態計量學分析;

    7、步驟4:成骨及凋亡相關標志物檢測;

    8、步驟5:染色檢測凋亡細胞,石蠟切片脫蠟、水化,加入甲基綠抗染液,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察,計算骨皮質內tunel陽性及tunel陰性的細胞數;

    9、步驟6:分析上頜前牙內收過程中腭側骨皮質骨陷窩-骨小管系統的變化;

    10、步驟7:體外培養骨細胞在流體剪切力下的力學響應;

    11、步驟8:篩選體外培養骨細胞力學響應關鍵蛋白a;

    12、步驟9:分析關鍵蛋白a在體外流體剪切力培養的骨細胞調控成骨細胞或破骨細胞功能的作用機制。

    13、進一步地,步驟1的具體過程為:

    14、選用18只24月齡的成年健康比格犬,所有動物符合國際實驗動物要求,體質量10-15kg,將實驗動物隨機分為兩組:加力組150g力值內收上頜切牙和對照組上頜前牙不加力;

    15、兩組實驗動物適應性圈養1周后,用3%戊巴比妥溶液按30mg/kg體質量肌注麻醉,藻酸鹽取模灌注硬石膏模型,制作個別帶環并焊接加力裝置,拔除雙側上頜第三前牙,粘接加力裝置。用鎳鈦拉簧自磨牙到前牙分別向兩組動物施加牽引力0g,150g,每周用測力計檢測一次牽引力大小,每周兩次2g/l氯己定清潔口腔,正常飲食,分別在正畸力負載第4周、第7周、第10周對實驗動物進行安樂死處理,采集組織標本。

    16、進一步地,步驟2的具體過程為:

    17、將標本上頜骨分離并切開,制成上頜前牙區實驗骨塊和對照骨塊,保存于4%多聚甲醛中固定48h,采用微計算機斷層掃描技術測量骨皮質孔隙率、骨皮質總面積、骨皮質面積、骨皮質厚度、礦物質含和礦物質密度,分析正畸力作用下骨皮質結構變化。

    18、進一步地,步驟3的具體過程為:

    19、在處死動物之前20、21天肌肉注射四環素;處死前第13、14天肌肉注射茜素紅,處死前第3、4天肌肉注射鈣黃綠素,劑量均為15mg/kg;

    20、從4%多聚甲醛中取出硬組織標本,用梯度乙醇脫水,有機玻璃包埋,待組織塊完全硬化后取出標本,修整組織塊,采用leitzl600型鋸式切片機進行切片,超聲清洗后貼片,打磨拋光,染色后中性樹膠封片,采用蘇木精-伊紅染色法、von?kossa染色、堿性磷酸酶染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色,檢測類骨質表面、成骨細胞表面、破骨細胞相對數量、骨吸收表面和礦化沉積率,進行骨皮質組織形態計量學分析,在細胞水平上反映骨轉換和骨重塑的變化。

    21、進一步地,步驟4的具體過程為:

    22、利用免疫組化檢測成骨標志物alp、runx2、ocn及凋亡標志物b淋巴細胞瘤-2、半胱氨酸蛋白酶-3的表達;

    23、從4%多聚甲醛中取出硬組織標本,常規制作石蠟切片,梯度乙醇脫水后加入配好的0.3%的過氧化氫甲醇溶液消除內源性過氧化物的影響,加入用血清稀釋液稀釋的一抗,4℃過夜,加入二抗,即生物素化羊抗兔igg,室溫孵育2h,加入顯色液,進行免疫組織化學顯色,梯度酒精脫水之后,封片,拍照,選取成骨活性最大組的加力時間作為后期實驗的參數。

    24、進一步地,步驟6的具體過程為:

    25、(1)激光掃描共聚焦顯微鏡觀察骨陷窩與骨小管系統形態變化

    26、將硬組織標本浸入含1%堿性品紅的梯度乙醇進行脫水及染色,聚甲基丙烯酸甲酯包埋后運用exakt切磨系統制作10μm切片,切片表面用砂紙拋光,激光掃描共聚焦顯微鏡觀察骨皮質中骨陷窩及骨小管的形態、面積大小、方向,濾鏡的熒光激發波長為580nm,100倍油鏡下截取2l層光學切片,每層間隔為0.5μm,總厚度為10μm;

    27、(2)掃描電子顯微鏡觀察骨陷窩-骨小管系統結構變化

    28、pmma包埋后的硬組織切片,經過拋光的表面向上以9%正磷酸腐蝕20s,隨后用去離子水清洗并于5%sodium?hypochlorite中浸泡5min,去離子水清洗,空氣干燥后噴金,用quanta?250掃描電子顯微鏡觀測骨小管直徑和骨陷窩密度。

    29、進一步地,步驟7的具體過程為:

    30、(1)構建體外培養骨細胞流體剪切力加載模型

    31、①骨細胞的分離培養與鑒定

    32、取股骨頸下組織塊,置于含10%青霉素-鏈霉素的α-mem中,去除多余組織并重復沖洗骨髓面,hbss沖洗3遍后將骨組織切成1cm2小塊,加入2mg/mlⅰ型膠原酶,消化15min后hbss清洗3遍,重復2次,加入含1%bsa的0.02%edta,培養箱培養25min后棄上清,hbss洗3次,重復加入ⅰ型膠原酶,消化25min后hbss洗3遍后收集清洗液與上清液,1200r/min離心5min,棄上清,培養基重懸后同消化后的骨組織種植于包被有i型鼠尾膠原蛋白的6孔板中,培養箱培養,傳代培養2-3代后通過形態學觀察、e11/gp38熒光染色、alp染色進行骨細胞鑒定;

    33、②流體剪切力加載模型構建

    34、使用平行板流動腔向骨細胞施加流體剪切力,加力裝置由上下兩層有機玻璃制成,下層中央有一個1cm×1cm×0.02cm的正方形槽,可放置長滿骨細胞的蓋玻片,上方有一個6cm×1.35cm×0.04cm的長方形槽,與上層有機玻璃共同形成液體流動的通道,通道兩端各開一個口用于注入和流出液體,液體是由灌流系統提供的具有固定定剪切力的液流,將第3代骨本文檔來自技高網...

    【技術保護點】

    1.上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:所述方法包括如下步驟:

    2.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟1的具體過程為:

    3.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟2的具體過程為:

    4.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟3的具體過程為:

    5.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟4的具體過程為:

    6.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟6的具體過程為:

    7.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟7的具體過程為:

    8.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟8的具體過程為:

    9.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟9的具體過程為:

    【技術特征摘要】

    1.上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:所述方法包括如下步驟:

    2.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟1的具體過程為:

    3.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟2的具體過程為:

    4.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測方法,其特征在于:步驟3的具體過程為:

    5.根據權利要求1所述的上頜腭側骨皮質重塑力學響應蛋白檢測...

    【專利技術屬性】
    技術研發人員:莫水學南瀾劉治強
    申請(專利權)人:廣西醫科大學
    類型:發明
    國別省市:

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