【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及人體細胞培養(yǎng)，具體為從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法。
技術(shù)介紹
1、血管平滑肌細胞(vascular?smooth?muscle?cells，vsmcs)是構(gòu)成血管中層的主要細胞成份，其收縮舒張、增殖、遷移和鈣化等與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)。體外培養(yǎng)人臍血管平滑肌細胞是研究心血管疾病發(fā)病機制及其防治工作的基礎(chǔ)和重要手段。
2、動脈血管平滑肌細胞的體外培養(yǎng)始于20世紀70年代，由ross和chamley用組織貼塊法培養(yǎng)成功；體外培養(yǎng)的血管平滑肌細胞可取自人體不同部位的動脈血管，如胸主動脈、腹主動脈、肺動脈、腦動脈、腸系膜動脈等；人臍靜脈血管不僅取材簡單，來源充沛，而且其平滑肌細胞活力強，較適合培養(yǎng)；血管平滑肌細胞的培養(yǎng)方法有多種，其中主要有酶消化法和組織塊貼壁法，不同的培養(yǎng)方法有不同的優(yōu)點和用處。
3、但是，現(xiàn)有技術(shù)不便防止細胞受損，及時進行傳代可以防止過度生長導(dǎo)致的接觸抑制，保持細胞的活性和增殖能力。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本專利技術(shù)提供了從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)不便防止細胞受損，及時進行傳代可以防止過度生長導(dǎo)致的接觸抑制，保持細胞的活性和增殖能力的問題。
2、為實現(xiàn)以上目的，本專利技術(shù)通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，包括以下步驟：獲取膠原酶a溶液；向處理后的人腹主動脈瘤壁組織標本中加入膠原酶a溶液后剪碎；將剪
3、進一步地，膠原酶a溶液的制備方法包括以下步驟：將膠原酶a溶解在smcm專用培養(yǎng)基中；加入0.25％胰酶；使用注射器和無菌過濾篩過濾溶液獲得膠原酶a溶液。
4、進一步地，所述無菌過濾篩的規(guī)格為0.22μm。
5、進一步地，人腹主動脈瘤壁組織標本的處理過程包括以下步驟：取離體0.5h-1h內(nèi)的人腹主動脈瘤壁組織，裝入pbs+三抗的混合液中移至超凈臺；用pbs+三抗的混合液反復(fù)沖洗，將人腹主動脈瘤壁組織上的血凝塊洗凈獲得人腹主動脈瘤壁組織標本。
6、進一步地，處理后的人腹主動脈瘤壁組織標本至于35mm2培養(yǎng)皿中；人腹主動脈瘤壁組織標本中加入膠原酶a溶液剪碎后的人腹主動脈瘤壁組織標本體積為1mm3。
7、進一步地，轉(zhuǎn)移至37度細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，包括以下步驟：將35mm2培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至37度細胞培養(yǎng)箱中；每隔30-60分鐘觀察一次，并用吸管反復(fù)吹打；重復(fù)4-6h。
8、進一步地，終止消化的處理過程為：在培養(yǎng)4-6h后，搖蕩見酶液渾濁，加入含預(yù)熱10％fbs?smcm培養(yǎng)基終止消化。
9、進一步地，所述終止消化后離心獲得細胞懸液，包括以下步驟：使用細胞過濾篩，除去未消化完全的組織碎片；每400g離心5min獲得細胞懸液。
10、進一步地，所述細胞過濾篩的規(guī)格為100μm。
11、進一步地，重懸細胞沉淀時使用無血清培養(yǎng)基；再次重懸細胞沉淀時使用10ml的10％fbs?smcm培養(yǎng)基。
12、本專利技術(shù)具有以下有益效果：
13、該從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，使用含抗生素的pbs可以防止細菌污染，并保持組織的生理平衡狀態(tài)，細碎的組織片可以增加酶與組織的接觸面積，膠原酶a幫助分解細胞外基質(zhì)，促進細胞的釋放，吹打幫助分散細胞，避免細胞聚集形成團塊，加入含血清的培養(yǎng)基可以中和消化酶的活性，防止細胞受損，觀察細胞生長狀態(tài)，及時進行傳代可以防止過度生長導(dǎo)致的接觸抑制，保持細胞的活性和增殖能力。
14、當然，實施本專利技術(shù)的任一產(chǎn)品并不一定需要同時達到以上所述的所有優(yōu)點。
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1.從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于，膠原酶A溶液的制備方法包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于，所述無菌過濾篩的規(guī)格為0.22μm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于，人腹主動脈瘤壁組織標本的處理過程包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于：處理后的人腹主動脈瘤壁組織標本至于35mm2培養(yǎng)皿中；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于，轉(zhuǎn)移至37度細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，包括以下步驟：
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于，終止消化的處理過程為：在培養(yǎng)4-6h后，搖蕩見酶液渾濁，加入含預(yù)熱10％FBSSMCM培養(yǎng)基
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于：所述終止消化后離心獲得細胞懸液，包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于：所述細胞過濾篩的規(guī)格為100μm。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于：重懸細胞沉淀時使用無血清培養(yǎng)基；
...【技術(shù)特征摘要】
1.從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于，膠原酶a溶液的制備方法包括以下步驟：
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于，所述無菌過濾篩的規(guī)格為0.22μm。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于，人腹主動脈瘤壁組織標本的處理過程包括以下步驟：
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的從人腹主動脈壁中分離、培養(yǎng)原代血管平滑肌細胞的方法，其特征在于：處理后的人腹主動脈瘤壁組織標本至于35mm2培養(yǎng)皿中；
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從人腹主動脈壁中分離、培...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：吳志遠，印華潤，趙寧，趙文心，尹洪超，李擁軍，
申請(專利權(quán))人：北京醫(yī)院，
類型：發(fā)明
國別省市：
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