【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及細(xì)胞治療領(lǐng)域，尤其涉及syn-car-t細(xì)胞的制備方法及其細(xì)胞和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、car-t細(xì)胞療法是將特異性抗原嵌合受體car的編碼基因轉(zhuǎn)入t細(xì)胞，然后再將細(xì)胞重新輸入患者體內(nèi)，通過t細(xì)胞表達(dá)的car識別腫瘤細(xì)胞表面的靶向抗原，激活t細(xì)胞殺傷活性，進(jìn)而釋放穿孔素、顆粒酶、細(xì)胞因子等發(fā)揮腫瘤殺傷作用的療法。car-t細(xì)胞會直接發(fā)揮抗腫瘤殺傷作用，無需主要組織相容性復(fù)合體(mhc)識別限制。
2、car-t細(xì)胞療法副作用包括細(xì)胞因子釋放綜合征，血細(xì)胞減少，神經(jīng)毒性綜合征，移植物抗宿主病(gvhd)，“on?target?off?tumor”毒性等等，其中“on?target?off?tumor”毒性與car-t細(xì)胞單一的機(jī)械的殺傷識別模式有關(guān)。
3、roybal等在2016年新開發(fā)一種synnotch系統(tǒng)，是一種“and?gate”回路系統(tǒng)，并成功應(yīng)用到car-t細(xì)胞治療中。synnotch系統(tǒng)作用方式：腫瘤細(xì)胞表面需同時(shí)表達(dá)相應(yīng)的2種抗原，才能激活synnotch?car-t(syn-car-t)細(xì)胞特異殺傷功能。因此，syn-car-t細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)智能型識別殺傷腫瘤這一目標(biāo)，從而提高car-t細(xì)胞治療的安全性。synnotch系統(tǒng)只改造替換了野生型notch受體的胞外區(qū)，胞內(nèi)區(qū)，下游效應(yīng)元件，保留notch受體的核心調(diào)控區(qū)。胞外區(qū)(輸入識別信號)可用靶向各種腫瘤細(xì)胞的同源特異性抗體的scfv分子替換(如cd19-scfv)，下游效應(yīng)元件(輸出轉(zhuǎn)錄信號)可用抗體scfv分子、細(xì)胞因子、免
4、synnotch是一種合成的notch受體，將鼠的notch1受體改造，胞外域用單鏈抗體替換(a抗體scfv(單鏈抗體))，胞內(nèi)域用轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域gal4vp64替換，僅保留可以被蛋白酶識別切割的跨膜核心域(nc)。notch受體蛋白由胞外區(qū)片段(necd)，跨膜區(qū)片段(tmd)，胞內(nèi)區(qū)片段(nicd)構(gòu)成。當(dāng)胞外區(qū)的受體與配體結(jié)合后，改變構(gòu)象，暴露酶切位點(diǎn)，被金屬蛋白酶和γ-分泌酶作用識別，進(jìn)行切割，裂解后釋放胞內(nèi)區(qū)nicd，nicd可以通過核定位信號nsl易位到細(xì)胞核中并發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用，從而激活下游信號通路。
5、synnotch系統(tǒng)的響應(yīng)程序代表了一種重構(gòu)t細(xì)胞響應(yīng)的策略，以synnotch?car-t細(xì)胞為例，腫瘤細(xì)胞表面需同時(shí)表達(dá)相應(yīng)的2種抗原，才能激活car-t細(xì)胞特異殺傷功能。因此，synnotch?car-t細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)精確識別殺傷腫瘤這一目標(biāo)。但是，synnotch系統(tǒng)較大，系統(tǒng)控制元件包括notch受體核心區(qū)，胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子gal4vp64，uas識別序列，內(nèi)部啟動子，一共2.5kb左右，系統(tǒng)可編輯區(qū)的輸入信號分子(如cd19-scfv)和輸出信號分子(如bcma-car)一共2.5kb左右，整個系統(tǒng)占據(jù)5kb左右，需通過2個慢病毒載體質(zhì)粒傳遞，即一個gal4誘導(dǎo)載體和一個uas效應(yīng)載體。所以轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞時(shí)不僅需要制備二種慢病毒載體，還需要進(jìn)行雙病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞。
6、synnotch系統(tǒng)還面臨一個問題，uas效應(yīng)載體未激活時(shí)不表達(dá)效應(yīng)分子，流式無法檢測轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，除非增加一個啟動子單獨(dú)表達(dá)一個熒光蛋白信號進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)效率檢測。采用慢病毒載體進(jìn)行雙病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞會產(chǎn)生一個制備生產(chǎn)問題，即制備雙陽性t細(xì)胞的效率低，需要進(jìn)行流式分選富集才能獲得雙陽率高的t細(xì)胞。此外，慢病毒載體由于vsv-g包膜蛋白毒性問題以及采用的是第三代自失活慢病毒載體進(jìn)行包裝，只能進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包裝，無法大規(guī)模制備，包裝滴度低，需要富集和純化，極大限制了syn-car-t細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用。由于上述原因極大限制了synnotch系統(tǒng)car-t細(xì)胞治療方面的應(yīng)用，需要進(jìn)一步進(jìn)行受體系統(tǒng)優(yōu)化或者載體優(yōu)化。
7、通過慢病毒載體傳遞synnotch系統(tǒng)所面臨的制備效率低下問題，可通過替換病毒載體進(jìn)行包裝來解決。目前常用的病毒載體包括γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(γ-rv)，γ-rv屬于簡單逆轉(zhuǎn)錄病毒，直徑約為100nm，有包膜，基因組是2個拷貝的正鏈rna，基因組大小為8.3kb左右，基因組只包括2個ltr，gag-pol，env。γ-rv只能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂期細(xì)胞，無法轉(zhuǎn)導(dǎo)非分裂期細(xì)胞，可以整合宿主基因組，包裝滴度高，插入外源目的基因大于4kb會極大降低載體包裝滴度。為了進(jìn)一步提高γ-rv的安全性，減少復(fù)制型rcr的產(chǎn)生，將γ-rv的3’ltr的u3啟動子刪除，改造成自失活γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(sin-rv)。
8、γ-rv載體具有成熟的大規(guī)模的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染包裝方法，生產(chǎn)滴度高，但是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是隨機(jī)整合到宿主染色質(zhì)中，有插入突變誘發(fā)宿主原癌基因表達(dá)的風(fēng)險(xiǎn)。sin-rv的u3增強(qiáng)子被刪除，致癌風(fēng)險(xiǎn)降低，極大提高了載體的安全性。sin-rv面臨的挑戰(zhàn)是大規(guī)模生產(chǎn)病毒載體的困難。由于缺失u3元件，無法構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞系，只有通過瞬時(shí)轉(zhuǎn)染包裝獲得，難以擴(kuò)大生產(chǎn)，而且使用傳統(tǒng)的方法很難篩選出產(chǎn)生sin-rv穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為了解決上述問題，本專利技術(shù)提供syn-car-t細(xì)胞的制備方法，所述方法包括：步驟1：利用piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的sin-γ-rv載體，即psr載體；步驟2：制備syncar質(zhì)粒載體：用步驟1制備的所述psr載體表達(dá)synnotch系統(tǒng)，將所述synnotch系統(tǒng)的gal4誘導(dǎo)載體和uas效應(yīng)載體合并在一個所述psr載體上，使得所述synnotch系統(tǒng)由一個所述psr載體進(jìn)行遞送，構(gòu)建syn?car逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒；和步驟3：將上述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞，制備得到所述syn-car-t細(xì)胞。
2、piggybac轉(zhuǎn)座子(pb)系統(tǒng)屬于dna轉(zhuǎn)座子，通過“剪切-粘貼”機(jī)制可將itr之間的目的基因整合到靶細(xì)胞基因組中并長期穩(wěn)定表達(dá)。pb系統(tǒng)，pb轉(zhuǎn)座子的末端是長13bp的反向重復(fù)序列(itr)，pb轉(zhuǎn)座酶由單獨(dú)質(zhì)粒表達(dá)。pb整合機(jī)制，雙質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后，pb轉(zhuǎn)座酶識別載體兩端的itr，從itr兩端切除成為游離的pb轉(zhuǎn)座子(攜帶目的基因)，基因組ttaa位點(diǎn)被切開形成黏性末端，pb轉(zhuǎn)座子被插入到基因組的“ttaa”位點(diǎn)進(jìn)行整合。
3、在一種實(shí)施方式中，所述syn?car逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒是靶向cd19分子，bcma分子，cd38分子，或gpc3分子的psr.synnotch載體的質(zhì)粒。
4、在一種實(shí)施方式中，所述syn?car逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒是靶向cd19分子的psr.synnotch載體的質(zhì)粒。
5、在一種實(shí)施方式中，步驟1中，在所本文檔來自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.Syn-CAR-T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述Syn?CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒是靶向CD19分子，BCMA分子，CD38分子，或GPC3分子的PSR.SynNotch載體的質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述Syn?CAR逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒是靶向CD19分子的PSR.SynNotch載體的質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中，在所述PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的PB轉(zhuǎn)座子5’ITR和3’ITR序列之間順序地插入SIN-γ-RV載體的5’LTR，5’UTR，和3’SIN-LTR序列；所述非編碼區(qū)UTR包括為病毒載體包裝信號的Ψ元件和為剪切供體位點(diǎn)的SD，所述3’SIN-LTR序列中U3區(qū)刪除，只保留R區(qū)和U5區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，5’UTR刪除所有Gag和Pol編碼區(qū)序列以及起始密碼子ATG。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，5’LTR和3’SIN-LTR之間分別插入Syn
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，在GAL4VP64蛋白下游添加P2A-EGFP熒光蛋白，作為載體受體蛋白CD19?scfv、BCMA?scfv、CD38?scfv或GPC3?scfv的檢測標(biāo)簽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一所述方法構(gòu)建的Syn-CAR-T細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的Syn-CAR-T細(xì)胞是靶向CD19的Syn-CAR-T細(xì)胞。
10.權(quán)利要求8所述的Syn-CAR-T細(xì)胞在制備腫瘤藥物中的應(yīng)用。
11.一種用于治療腫瘤的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有權(quán)利要求8所述的CAR-T細(xì)胞，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
12.一種體外抑制腫瘤細(xì)胞的方法，其特征在于，包括將腫瘤細(xì)胞與如權(quán)利要求8所述的CAR-T細(xì)胞或如權(quán)利要求11所述的藥物組合物接觸，從而抑制所述腫瘤細(xì)胞。
...【技術(shù)特征摘要】
1.syn-car-t細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述syn?car逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒是靶向cd19分子，bcma分子，cd38分子，或gpc3分子的psr.synnotch載體的質(zhì)粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述syn?car逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的質(zhì)粒是靶向cd19分子的psr.synnotch載體的質(zhì)粒。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟1中，在所述piggybac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)的pb轉(zhuǎn)座子5’itr和3’itr序列之間順序地插入sin-γ-rv載體的5’ltr，5’utr，和3’sin-ltr序列；所述非編碼區(qū)utr包括為病毒載體包裝信號的ψ元件和為剪切供體位點(diǎn)的sd，所述3’sin-ltr序列中u3區(qū)刪除，只保留r區(qū)和u5區(qū)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，5’utr刪除所有g(shù)ag和pol編碼區(qū)序列以及起始密碼子atg。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，5’ltr和3’sin...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：王建勛，陳靜，張野，王文娟，馮婭茹，
申請(專利權(quán))人：廣東君厚生物醫(yī)藥有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
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