【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及生物檢測，具體涉及檢測萬古霉素耐藥基因的引物探針組合、檢測試劑、檢測試劑盒及其應用。
技術介紹
1、萬古霉素屬糖肽類抗菌藥物，它是通過干擾細菌細胞壁結構中的關鍵組分肽聚糖來干擾細胞壁的合成，抑制細胞壁中磷脂和多肽的生成。是目前治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和耐藥腸球菌等革蘭陽性菌感染的一線用藥。
2、腸球菌(enterococcus)是醫院感染的常見條件致病菌。近年來，耐萬古霉素腸球菌(vancomycin-resistant?enterococcus，vre)感染率逐年上升，7％～10％的菌血癥由腸球菌感染引起。vre可引起人體多部位感染，主要是廣譜抗菌藥物選擇性的結果。vre可通過血液感染或定植生長方式進行直接傳播，也可通過食物、醫療器械、污染環境、醫護人員接觸等方式間接傳播。vre包括耐萬古霉素屎腸球菌和耐萬古霉素糞腸球菌，有明顯的耐藥性，涉及vana、vanb、vand、vanm和vann等表型，其中vana、vanb、vand、vanm可以編碼合成d-ala-d-lac為末端的肽聚糖前體，介導萬古霉素中度或高度耐藥。目前，屎腸球菌和糞腸球菌已對萬古霉素、青霉素和替考拉寧等多種抗菌藥物產生抗性，快速識別耐藥細菌病原體及其特征在感染的防控工作中發揮著重要的作用，為提高對vre的防控效率，早期預防其院內傳播，必須盡快查明耐藥腸球菌的攜帶者具有非常重要的意義。
3、現有技術中針對萬古霉素耐藥基因的檢測存在基因覆蓋不全、檢測方法或引物設計復雜、產物回收后測序困難，不能用來克隆；假
技術實現思路
1、有鑒于此，本專利技術要解決的技術問題在于提供檢測萬古霉素耐藥基因的引物探針組合、檢測試劑、檢測試劑盒及其應用，本專利技術提供了快速檢測萬古霉素耐藥基因的引物探針組合，檢測結果準確可靠、靈敏度較高，能有效地起到準確診斷、耐藥溯源、耐藥控制等作用。
2、本專利技術提供了引物探針組合，包括引物組x和探針x；
3、所述引物組x包括引物(2x-1)和引物2x；
4、所述引物(2x-1)具有：
5、(1)、如seq?id?no:(3x-2)所示的核苷酸序列；或
6、(2)如(1)所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(1)的相同或相似；或
7、(3)、與(1)或(2)所示的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；
8、所述引物2x具有：
9、(4)、如seq?id?no:(3x-1)所示的核苷酸序列；或
10、(5)如(4)所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(4)的相同或相似；或
11、(6)、與(4)或(5)所示的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；
12、所述探針x具有：
13、(7)、如seq?id?no:(3x)所示的核苷酸序列；或
14、(8)如(7)所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(7)的相同或相似；或
15、(9)、與(7)或(8)所示的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列；
16、所述x包括1至4之間的任意一個或多個整數。
17、在本專利技術的一些具體實施方案中，鑒定耐藥基因vana的引物探針組合包括：正向引物具有如seq?id?no:1所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?id?no:2所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:3所示的核苷酸序列。
18、在本專利技術的一些具體實施方案中，鑒定耐藥基因vanb的引物探針組合包括：正向引物具有如seq?id?no:4所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?id?no:5所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:6所示的核苷酸序列。
19、在本專利技術的一些具體實施方案中，鑒定耐藥基因vand的引物探針組合包括：正向引物具有如seq?id?no:7所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?id?no:8所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:9所示的核苷酸序列。
20、在本專利技術的一些具體實施方案中，鑒定耐藥基因vanm的引物探針組合包括：正向引物具有如seq?id?no:10所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?id?no:11所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:12所示的核苷酸序列。
21、在一些實施例中，還包括內標基因的引物探針組，所述內標基因包括β-珠蛋白或gadph基因。
22、在一些具體實施例中，所述內標基因為β-珠蛋白，所述β-珠蛋白的引物探針組包括：
23、(10)、正向引物具有如seq?id?no:13所示的核苷酸序列，反向引物具有如seq?idno:14所示的核苷酸序列，探針具有如seq?id?no:15所示的核苷酸序列；或
24、(11)如(10)所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且功能與(10)的相同或相似；或
25、(12)、與(10)或(11)所示的核苷酸序列具有至少90％序列同源性的核苷酸序列。
26、本專利技術提供了所述的引物探針組合在制備檢測萬古霉素耐藥基因的試劑或試劑盒中的應用：
27、所述耐藥基因包括vana、vanb、vand和vanm中的至少一種。
28、本專利技術提供了試劑，包括所述的引物探針組合，以及可接受的輔料和助劑。
29、本專利技術提供了試劑盒，包括所述的引物探針組合或所述的試劑，以及pcr反應試劑。
30、在一些實施例中，所述pcr反應試劑包括：buffer、dntps、dna聚合酶、樣品dna、mgcl2和h2o。
31、在一些實施例中，所述pcr反應試劑包括dutp。
32、在一些具體實施例中，所述buffer包括：
33、
34、
35、在一些具體實施例中，
36、所述buffer包括：
37、
38、在本專利技術的一些具體實施例中，所述試劑盒的pcr反應體系包括：
39、
40、在一些實施例中，所述pcr的反應程序包括：
41、
42、本專利技術還提供了如下任意項在檢測萬古霉素耐藥基因vana、vanb、vand和vanm中的應用：
43、i、所述的引物探針組合；和/或
44、ii、所述的試劑；和/或
45、iii、所述的試劑盒。
46、本專利技術提供了如下任意項在篩選抗耐萬古霉素細菌的藥物中的應用：
47、i、所述的引物探針組合；和/或
48、ii、所述的試劑；和/或
49、iii、所述的試劑盒。
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【技術保護點】
1.引物探針組合，其特征在于，包括引物組X和探針X；
2.根據權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，還包括內標基因的引物探針組，所述內標基因包括β-珠蛋白或GADPH基因。
3.根據權利要求2所述的引物探針組合，其特征在于，所述內標基因為β-珠蛋白，所述β-珠蛋白的引物探針組包括：
4.權利要求1～3任一項所述的引物探針組合在制備檢測萬古霉素耐藥基因的試劑或試劑盒中的應用：
5.試劑，其特征在于，包括權利要求1～3任一項所述的引物探針組合，以及可接受的輔料和助劑。
6.試劑盒，其特征在于，包括權利要求1～3任一項所述的引物探針組合或權利要求5所述的試劑，以及PCR反應試劑。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應試劑包括：Buffer、dNTPs、DNA聚合酶、樣品DNA、MgCl2和H2O。
8.根據權利要求7所述的試劑盒，其特征在于，所述Buffer包括：
9.根據權利要求6～8任一項所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR的反應程序包括：
10.如
...【技術特征摘要】
1.引物探針組合，其特征在于，包括引物組x和探針x；
2.根據權利要求1所述的引物探針組合，其特征在于，還包括內標基因的引物探針組，所述內標基因包括β-珠蛋白或gadph基因。
3.根據權利要求2所述的引物探針組合，其特征在于，所述內標基因為β-珠蛋白，所述β-珠蛋白的引物探針組包括：
4.權利要求1～3任一項所述的引物探針組合在制備檢測萬古霉素耐藥基因的試劑或試劑盒中的應用：
5.試劑，其特征在于，包括權利要求1～3任一項所述的引物探針組合，以及可接受的輔料和助劑。...
【專利技術屬性】
技術研發人員：鄭業煥，王京京，汪睿，高歌，陳曉妍，高利飛，付光宇，吳學煒，
申請(專利權)人：鄭州安圖生物工程股份有限公司，
類型：發明
國別省市：
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