【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于植物基因工程，更具體地說(shuō)，涉及一種基于lhahl10/15基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法。
技術(shù)介紹
1、雜交鵝掌楸(liriodendron?sino-americanum?p.c.yieh?ex?shang?etz.r.wang)，也稱為雜種鵝掌楸或雜交馬褂木，是一種木蘭科鵝掌楸屬的植物。它是通過(guò)人工雜交，以鵝掌楸為母本、北美鵝掌楸為父本獲得的。雜交鵝掌楸的葉片形似馬褂，因此也被稱為雜交馬褂木。其花較大，黃色，具清香，單生于枝頂，形似郁金香，所以又被稱為“木本郁金香”。其生長(zhǎng)速度快，木材質(zhì)地好，是一種珍貴的商品樹種。葉型似馬褂，開花如金盞，是優(yōu)秀的園林綠化樹種。其是古老的孑遺植物，曾廣泛分布于北半球的溫帶地區(qū)。北美鵝掌楸原產(chǎn)北美東南部，我國(guó)青島、廬山、南京、廣州等地也有分布。鵝掌楸屬植物雌雄花期不遇導(dǎo)致其自然繁殖效率低下，目前鵝掌楸屬樹種的繁育方式一般采用無(wú)性繁殖，包括扦插、嫁接、組織培養(yǎng)等。但是，扦插及嫁接的人工繁育手段難度大且存活率低下。
2、體細(xì)胞胚胎發(fā)生是植物細(xì)胞全能性的體現(xiàn)，體細(xì)胞或其他細(xì)胞在沒有經(jīng)過(guò)受精的情況下發(fā)育成胚胎的一種方式。體胚發(fā)生受到多方面的調(diào)控，如轉(zhuǎn)錄因子、激素、表觀遺傳修飾等。特定的轉(zhuǎn)錄因子異位表達(dá)或者某些染色質(zhì)修飾蛋白的缺失會(huì)導(dǎo)致體細(xì)胞獲得全能性從而轉(zhuǎn)化為具有胚性的細(xì)胞。在前人的研究中報(bào)道了許多單個(gè)基因的異位表達(dá)可以直接誘導(dǎo)體胚發(fā)生的基因，如bbm(baby?boom)、wus(wuschel)、lec?1(leafy?cotyledon?1)、ahl15(at-h
3、在擬南芥胚胎發(fā)育過(guò)程中，ahl基因從胚胎發(fā)育早期就有較高的表達(dá)水平，說(shuō)明在胚胎發(fā)育早期ahl15就參與了胚胎發(fā)育。直至球形胚時(shí)期，ahl15的表達(dá)遍布整個(gè)胚體，心形胚及子葉形胚中ahl15的表達(dá)水平較高，對(duì)胚胎形態(tài)建成也起到了重要作用。這些研究都表明了ahl基因家族在胚胎發(fā)育過(guò)程及體胚發(fā)育過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用。在2,4-d誘導(dǎo)的體胚發(fā)生中，ahl基因可能作用于2,4-d的下游和yuc介導(dǎo)的生長(zhǎng)素生物合成的上游。此外，bbm和ahl協(xié)同作用于體胚發(fā)生，可以激活下游yuc基因的表達(dá)。體細(xì)胞胚胎發(fā)生除了為生物技術(shù)及分子育種提供技術(shù)手段外，還為探究植物胚胎發(fā)育過(guò)程及分子調(diào)控機(jī)制提供重要的研究基礎(chǔ)。
4、目前，在林木的體細(xì)胞胚胎中的研究大多數(shù)停留在對(duì)于體胚發(fā)生條件的優(yōu)化和改善，對(duì)于體胚發(fā)生的分子機(jī)制研究還不多。加強(qiáng)對(duì)體細(xì)胞胚發(fā)生調(diào)控機(jī)制的研究，有利于進(jìn)一步為體胚發(fā)生能力低下的植物提供參考基因，并提高體胚發(fā)生能力及效率。雜交鵝掌楸作為一種具有巨大潛在經(jīng)濟(jì)價(jià)值的植物，存在天然結(jié)實(shí)率低,繁殖能力差，雜交種供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。提高其體胚發(fā)生和植株再生效率的研究對(duì)于其種質(zhì)資源的保存、遺傳改良和快速繁殖具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本專利技術(shù)所要解決的技術(shù)問題在于提供一種基于lhahl10/15基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，用于調(diào)控雜交鵝掌楸體胚的形成和發(fā)育。
2、為了解決上述技術(shù)問題，本專利技術(shù)所采用的技術(shù)方案如下：
3、一種基于lhahl15基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，通過(guò)調(diào)控lhahl15基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的目的；所述lhahl15基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
4、所述調(diào)控lhahl15基因表達(dá)為促進(jìn)lhahl15基因表達(dá)。
5、基于lhahl15基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，包括：
6、1)構(gòu)建雜交鵝掌楸lhahl15基因的過(guò)表達(dá)載體；
7、2)將構(gòu)建的雜交鵝掌楸lhahl15基因的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到雜交鵝掌楸中；
8、3)培育篩選并獲得體胚發(fā)生效率顯著提高的轉(zhuǎn)基因雜交鵝掌楸植株。
9、一種基于lhahl10基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，通過(guò)調(diào)控lhahl10基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的目的；所述lhahl10基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示
10、所述調(diào)控lhahl10基因表達(dá)為抑制lhahl10基因表達(dá)。
11、基于lhahl10基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，包括：
12、1)構(gòu)建雜交鵝掌楸lhahl10基因的編輯載體；
13、2)將構(gòu)建的雜交鵝掌楸lhahl10基因的編輯載體轉(zhuǎn)化到雜交鵝掌楸中；
14、3)培育篩選并獲得體胚發(fā)生效率顯著提高的轉(zhuǎn)基因雜交鵝掌楸植株。
15、雜交鵝掌楸lhahl15基因在調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)中的應(yīng)用。
16、所述體胚發(fā)生相關(guān)基因?yàn)閎bm、lec1、pin1、plt2。
17、雜交鵝掌楸lhahl10基因在調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)中的應(yīng)用。
18、所述體胚發(fā)生相關(guān)基因?yàn)閘ec1、pin1、plt2。
19、相比于現(xiàn)有技術(shù)，本專利技術(shù)的有益效果為：
20、1)本專利技術(shù)通過(guò)促進(jìn)lhahl15基因表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的目的，lhahl15基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示；構(gòu)建雜交鵝掌楸lhahl15基因的過(guò)表達(dá)載體；將構(gòu)建的雜交鵝掌楸lhahl15基因的過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到雜交鵝掌楸中；培育篩選并獲得體胚發(fā)生效率顯著提高的轉(zhuǎn)基因雜交鵝掌楸植株。
21、2)本專利技術(shù)通過(guò)抑制lhahl10基因的表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的目的，lhahl10基因的核苷酸序列如seq?id?no.1所示；構(gòu)建雜交鵝掌楸lhahl10基因的編輯載體；將構(gòu)建的雜交鵝掌楸lhahl10基因的編輯載體轉(zhuǎn)化到雜交鵝掌楸中；培育篩選并獲得體胚發(fā)生效率顯著提高的轉(zhuǎn)基因雜交鵝掌楸植株。
22、3)本專利技術(shù)結(jié)果表明，在不含有外源激素的培養(yǎng)基上，過(guò)表達(dá)lhahl15促進(jìn)體胚發(fā)生，而基因編輯的株系(ahl15-ko)體胚發(fā)生數(shù)量減少，且大部分停滯在球形胚階段，少量體胚可以繼續(xù)發(fā)育。過(guò)表達(dá)可以形成完整的子葉胚，而基因編制則會(huì)導(dǎo)致體胚發(fā)育畸形，無(wú)法形成正常植株。與對(duì)照組相比，lhahl10-oe的體胚數(shù)量顯著上升，但是體胚的發(fā)育停滯在球形胚階段，且球形胚的體積顯著大于對(duì)照組體胚。ahl10-ko的體胚誘導(dǎo)數(shù)量與對(duì)照相比數(shù)量顯著上升且與過(guò)表達(dá)的體胚誘導(dǎo)數(shù)量相近。
23、4)本專利技術(shù)結(jié)果表明，ahl15-ko突變體愈傷組織誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚胎的下胚軸基部膨大且出現(xiàn)胚根缺失的現(xiàn)象。在小植株時(shí)期，根端發(fā)育停滯且出現(xiàn)愈傷組織的堆積。過(guò)表達(dá)lhahl15的子葉胚相對(duì)于野生型和空載而言，胚軸更加粗壯且子葉肉質(zhì)化。在幼苗階段，過(guò)表達(dá)lhahl15具有粗壯的莖和肉質(zhì)的葉片。ahl10-ko突變體陽(yáng)性愈傷組織誘導(dǎo)的體細(xì)胞胚胎的體積明顯小于對(duì)照組，但是胚胎發(fā)育完整無(wú)明顯缺陷。過(guò)表達(dá)lhahl10的子葉胚發(fā)育紊亂，無(wú)明顯胚本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...
【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.一種基于LhAHL15基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，通過(guò)調(diào)控LhAHL15基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的目的；所述LhAHL15基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，所述調(diào)控LhAHL15基因表達(dá)為促進(jìn)LhAHL15基因表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，包括：
4.一種基于LhAHL10基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，通過(guò)調(diào)控LhAHL10基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的目的；所述LhAHL10基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，所述調(diào)控LhAHL10基因表達(dá)為抑制LhAHL10基因表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，包括：
7.雜交鵝掌楸LhAHL15基因在調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)中的應(yīng)用。p>
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述體胚發(fā)生相關(guān)基因?yàn)锽BM、LEC1、PIN1、PLT2。
9.雜交鵝掌楸LhAHL10基因在調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生相關(guān)基因表達(dá)中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于，所述體胚發(fā)生相關(guān)基因?yàn)長(zhǎng)EC1、PIN1、PLT2。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種基于lhahl15基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，通過(guò)調(diào)控lhahl15基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的目的；所述lhahl15基因的核苷酸序列如seq?id?no.3所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，所述調(diào)控lhahl15基因表達(dá)為促進(jìn)lhahl15基因表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，包括：
4.一種基于lhahl10基因的雜交鵝掌楸體胚發(fā)生體系建立方法，其特征在于，通過(guò)調(diào)控lhahl10基因的表達(dá)，從而達(dá)到調(diào)控雜交鵝掌楸體胚發(fā)生的目的；所述lhahl10基因的核苷酸序列如seq?id?...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：陳金慧，魯路，唐窈，李漪汭，潘隆應(yīng)，鄭仁華，張金芳，羅水金，劉美利，郝兆東，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：南京林業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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