【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選方法，屬于動物行為學與分子生物學領域。
技術介紹
1、攻擊性是動物界中普遍存在的重要個性特征，對個體的資源獲取、成長、生活史以及適應性具有深遠的影響。不同攻擊性的個體通常表現出與其競爭能力相匹配的行為如，強攻擊性個體表現出競爭和資源壟斷行為，弱攻擊性個體則避免直接競爭資源和代價高昂的社會互動。
2、攻擊性作為一種復雜的數量性狀，受許多基因表達的影響。如，與斑馬魚(daniorerio)攻擊持續時間顯著相關的基因模塊有12個；細胞色素p450基因家族以及與電子傳遞、電壓門控鉀通道、分解代謝、g蛋白偶聯受體信號傳導以及基本細胞和代謝過程相關的基因均與攻擊行為有關。大量的基因表達模式可以被看作是控制攻擊性的神經基因組狀態的肖像，不同的攻擊性表型與中樞神經系統中不同的基因表達模式相對應。了解這些機制不僅有助于深入揭示甲殼動物的行為學特點，也為甲殼動物選育及資源管理提供了理論基礎。
3、傳統池塘養殖條件下，蟹類經常面臨有限的空間、食物和群體組成的反復變化等問題，它們比在自然環境下更容易發生種內殘食，導致附肢殘缺甚至死亡。殘缺的個體攝食更加困難，因此它們的生長速度往往會受到影響，從而導致養殖品質下降，養殖產量減少，因此，基于經濟蟹類攻擊性性狀的新品種選育十分必要。本專利技術將行為學與分子生物學研究相結合，建立了蟹類攻擊性基因篩選方法，通過層級篩選機制識別出關鍵的調控基因，為今后蟹類種質創新和新品種選育提供新思路。
技術實現思路p>
1、本專利技術的目的是應用行為學與分子生物學技術，提供一種蟹類攻擊性基因篩選的方法，為蟹類優良品種的選育提供分子技術支持。
2、為實現上述專利技術目的，本專利技術采用的技術方案如下：
3、一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，包括：
4、步驟1，通過鏡像實驗與攻擊性評測模型評估蟹的攻擊性，選取不同攻擊性表型的蟹；
5、其特征還包括以下步驟：
6、步驟2，利用轉錄組學分析，識別不同攻擊性表型蟹胸神經節的差異基因，每組生物學重復不少于3；
7、步驟3，對差異基因進行kegg富集分析，篩選前n條差異信號通路，以得到攻擊性差異基因子集；
8、1.采用r語言對步驟2獲取的差異基因進行kegg通路富集分析；
9、2.對上述分析結果采用fisher精確檢驗，當p<0.05時，說明該kegg通路功能存在顯著富集情況，顯著富集的kegg通路數量記為q1；
10、3.將顯著富集的kegg通路按p值從小到大進行排序，最終得到的差異基因子集中的基因數量記為q2：
11、情況1：q1≥20
12、若n＝20時，q2≤500，則篩選前20條差異信號通路中富集的基因作為差異基因子集；
13、若n＝20時，q2>500，則計算前n-1條差異信號通路中富集的基因，直到q2≤500；情況2：q1<20
14、若n＝q1時，q2≤500，則篩選前q1條差異信號通路中富集的基因作為差異基因子集；
15、若n＝q1時，q2>500，則計算前n-1條差異信號通路中富集的基因，直到q2≤500。
16、步驟4，通過基因集富集分析(gsea)，篩選差異基因子集中對富集得分貢獻大的基因，作為目標基因集：
17、1.若q2≤50，則差異基因子集中的基因全部作為目標基因集，直接進行步驟5；
18、若q2>50，則通過r語言對差異基因子集進行gsea分析；
19、2.gsea的篩選標準為|nes|>1，fdr<0.25，其中nes為標準化富集得分，fdr為多重假設檢驗矯正后的p值；|nes|越大，fdr值越小，富集越顯著；
20、3.對差異基因子集中的基因，根據nes得分采用signal2noise排序算法，先驗基因集的大小(根據差異基因子集的基因數量設置)為15～q2；
21、4.將對富集得分貢獻最大的基因成員組合，作為目標基因集。
22、步驟5，采用表達量相關性分析，獲取攻擊性表型調控的關鍵基因集；
23、步驟6，以關鍵基因集中的受體蛋白為核心調控蛋白。
24、所述步驟1中，進行攻擊性評測采用如下方式：
25、1.將蟹于水族缸中隔離暫養兩周；
26、2.選取健康、附肢完整和處于蛻殼間期的蟹進行鏡像實驗，重復拍攝3次，每次間隔不少于24h；
27、3.通過行為分析軟件記錄并量化蟹的攻擊性行為，包括靜止累計持續時間和相對移動距離(移動距離與甲寬的比值)；
28、4.基于蟹的攻擊性評測模型，計算攻擊性得分，以得到不同攻擊性表型的蟹；
29、所述步驟1中，進行鏡像實驗采用如下方式：
30、選取內壁呈不透明白色的觀察缸，攝像機固定于觀察缸正上方，取寬度與觀察缸內徑相等的兩面鏡子，將兩面鏡子背面貼合垂直放置于觀察缸中部，以使兩側區域可同時進行鏡像實驗(圖2，3)；將觀察缸中鏡子兩側區域各插入一隔板，將兩只蟹分別放入隔板一側區域，使蟹與鏡子之間被隔板隔開，適應10min后輕輕地取出隔板，使蟹暴露于鏡子前，拍攝20min后結束；每組拍攝結束后，更換觀察缸中的海水并清洗觀察缸。拍攝時統一在無光的環境條件下進行，實驗期間控制海水溫度和鹽度與暫養條件一致。
31、所述步驟1中，以行為分析軟件記錄并量化蟹的攻擊性行為如下：
32、設置檢測的采樣率為8幀/秒，檢測方法為動態剪影法或灰度梯度法，開啟丟失幀數校正和平滑軌跡設置；軌跡平滑配置為：
33、a.基于每個采樣點前后10個樣本進行平滑處理；
34、b.若移動距離小于3cm時，將采樣點仍舊設為前一個位置；
35、c.若移動的最大距離大于20cm時，將采樣點設為缺失。
36、所述步驟1中，攻擊性評測模型為，
37、y＝0.023x1-0.001x2-0.002
38、其中，y為攻擊性得分，x1為相對移動距離，x2為靜止累計持續時間。
39、所述步驟1中，進行攻擊性評測之后，
40、將蟹進行冰凍麻醉5分鐘后，于冰上迅速解剖并取出胸神經節置于2ml凍存管中，立即放入液氮中短暫速凍，隨后放入-80℃冰箱中保存待測。
41、所述步驟2中，包括采集原始測序數據及轉錄組學分析：
42、其中，采集原始測序數據包括：
43、1.從步驟1中隨機選取每種攻擊性表型的蟹不少于2只進行混樣，每組至少設置3個生物學重復；
44、2.采用trizol法提取總rna，通過1％的瓊脂糖凝膠電泳測定rna完整度，用nanodrop?2000核酸蛋白分析儀檢測總rna的濃度和純度，確保a260/a280在1.8～2.0；
45、3.從樣品本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟1中，進行攻擊性評測采用如下方式：
3.如權利要求2所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟1中，進行鏡像實驗采用如下方式：
4.如權利要求2所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟1中，所述步驟1中，以行為分析軟件記錄并量化蟹的攻擊性行為如下：
5.如權利要求2所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟1中，所述步驟1中，攻擊性評測模型為，
6.如權利要求1所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟2中，包括采集原始測序數據及轉錄組學分析：
7.如權利要求1所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟5中，采用表達量相關性分析，獲取攻擊性表型調控的關鍵基因集包括以下步驟：1.通過R語言對目標基因集進行表達相關性分析，生成一
8.如權利要求1-7所述的基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選方法，在蟹類種質創新和新品種選育中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟1中，進行攻擊性評測采用如下方式：
3.如權利要求2所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟1中，進行鏡像實驗采用如下方式：
4.如權利要求2所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟1中，所述步驟1中，以行為分析軟件記錄并量化蟹的攻擊性行為如下：
5.如權利要求2所述的一種基于高通量測序的蟹類攻擊性基因篩選的方法，其特征是所述步驟...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王芳，梁啟航，劉大鵬，朱柏杉，
申請(專利權)人：中國海洋大學，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。