【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于基因工程，具體涉及牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1及其編碼蛋白在小立碗蘚葉綠素代謝和類胡蘿卜素代謝中的應用。
技術介紹
1、小立碗蘚屬于葫蘆蘚科小立碗蘚屬，分布于歐洲、亞洲、非洲及大洋洲，是最早登陸的高等植物之一，在植物進化樹上處于特殊地位(rensing?et?al.,2020)。小立碗蘚在約四十年前被發現，自此之后它成為植物系統發育學研究的重要對象，它還是首個被測序的非種子植物，其基因組信息公開且完善(rensing?et?al.,2008)；通過同源重組的方式可成功將外源基因轉入小立碗蘚的基因組，圍繞其已建立成熟的遺傳轉化方法(strepp?etal.,1998)；此外，小立碗蘚還具有繁殖周期短等重要優點(cove?et?al.,1997)，是分子生物學研究中重要的模式生物，圍繞其展開的研究涵蓋植物激素、植物營養、植物向地形、植物感光性等多個方向和領域(rensing?et?al.,2020)。由于小立碗蘚是最早登陸的非維管植物，其生境與原始水生植物及后期進化的高等植物都不同，小立碗蘚有獨特的光保護體系(alessandro?alboresia,2010)。
2、植物在光合作用的過程中，需要應對不斷變化的光強，在進化的過程中產生應對波動光尤其是高光的光保護機制，植物進行光合作用時，光系統ii的捕光色素蛋白復合體借助葉綠素、胡蘿卜素等感光色素吸收光能并將能量傳遞至光反應中心，為光合作用的反應提供能量，在此過程中多余的能量會通過類胡蘿卜素淬滅(ostroumov?et?al.,201
3、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸(ggpp)是牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶(ggpps)的產物，它在植物中供應多個初級代謝產物流和次級代謝產物流，這些產物包括類胡蘿卜素極其衍生物(脫落酸、獨腳金內酯)，葉綠素、生育酚、赤霉素、質體醌等重要的萜類化合物(tholl,2015)。在辣椒、番茄、水稻、煙草等重要的作物中，ggpps家族的功能被鑒定，圍繞其展開的一系列遺傳學實驗證實ggpps在體內參與植物葉綠素、胡蘿卜素等光合色素的合成(zhou?et?al.,2017；wang?et?al.,2018；zhou?and?pichersky,2020)；在擬南芥這一高等模式植物中，ggpps家族的功能也被詳細注釋，研究者發現盡管擬南芥中存在12個ggpps同源蛋白，其中發揮主效ggpp合成的僅有一個，并且它與胡蘿卜素合成相關的下游蛋白存在物理水平的相互作用(ruiz-sola?et?al.,2016)；在金魚草、薄荷、薰衣草中發現ggpps還與植物揮發物的合成緊密相關，可應用于揮發物相關的作物遺傳改良(orlova?et?al.,2009；adal?and?mahmoud,2020)；在巨冷杉等裸子植物中鑒定了數個多功能的ggpps，它們可以同時合成揮發性單萜物質的前體牻牛兒基二磷酸(gpp)以及ggpp(schmidt?et?al.,2010)。植物ggpps的研究進展顯示，針對非種子陸地植物的ggpps功能研究是一片空白，對小立碗蘚ggpps的功能研究不僅可以為色素代謝相關的研究提供基礎，也具有作物遺傳改良的應用前景。
技術實現思路
1、專利技術目的：為了克服現有技術中存在的不足，本專利技術提供一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因及其編碼蛋白和應用，基因轉錄編碼牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶ppatggpps1，可以合成牻牛兒基牻牛兒基二磷酸，從而使小立碗蘚中能夠合成葉綠素、胡蘿卜素等色素。
2、技術方案：為實現上述目的，本專利技術采用的技術方案為：
3、一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1，它的核苷酸序列如序列表seq?id?no:1所示。
4、一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因的編碼蛋白，它的氨基酸序列如序列表seq?id?no:2所示。
5、本專利技術的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因基因來源于小立碗蘚(physcomitrella?patens)，名稱為ppatggpps1，以下該基因簡稱為ppatggpps1。
6、一種重組表達載體，包括牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因。
7、一種轉化子，包括重組表達載體的宿主細胞。
8、所述的一種轉化子，它的宿主為微生物、植物或轉基因細胞系。
9、一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的獲取方法，包括以下步驟：
10、步驟1，總rna的提取
11、小立碗蘚(physcomitrella?patens)，應用rnaiso試劑盒(takara)提取得到小立碗蘚的總rna，經紫外分光光度計檢測確認rna的完整性以及濃度。
12、步驟2，小立碗蘚牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因(ppatggpps1)的克隆及表達載體的構建。
13、應用1μg步驟1獲得的總rna作為反轉錄模板，按照primescript?1st?strand?cdnasynthesis?kit(takara)的說明書操作，經反轉錄合成cdna第一鏈后，應用發轉錄pcr程序進行pcr擴增，以獲得牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的orf全長，此時的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1帶有pmal-c5x同源臂，其中：
14、f端引物如下：
15、gcggccgcgatatcgtcgac?atgggttcaacagtggtctcataca
16、r端引物如下：
17、taattacctgcagggaattc?ctaattctgcctgtaagcgatgtag
18、其中，小寫字母代表同源臂序列，大寫字母是作為引物的基因的序列。
19、步驟3，將帶有pmal-c5x同源臂的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的基因片段根據clonexpress?ii?one?step?cloning?kit(vazyme)試劑盒的操作說明進行同源重組，測序后經拼接獲得具有完整編碼區的小立碗蘚牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1，牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的核苷酸序列如序列表seqid?no:1所示。
20、步驟4，酶活鑒定
21、利用大腸桿菌色素系統進行小立碗蘚牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因ppatggpps1的酶活鑒定。大腸桿菌可以合成牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶的底物，但是無法將其轉化為牻牛兒基牻牛兒基二磷酸；此外，該色素系統用到質粒pa本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因，其特征在于：它的核苷酸序列如序列表SeqID?No:1所示。
2.一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因的編碼蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如序列表Seq?ID?No:2所示。
3.根據權利要求1或2所述的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因的編碼蛋白，其特征在于：牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶來源于小立碗蘚。
4.一種重組表達載體，其特征在于：包括權利要求1或2所述的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因。
5.一種轉化子，其特征在于：包括權利要求4所述的重組表達載體的宿主細胞。
6.根據權利要求5所述的一種轉化子，其特征在于：它的宿主為微生物、植物或轉基因細胞系。
7.一種根據權利要求1所述牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟：
8.一種基于權利要求1所述的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因的應用，其特征在于：它應用于小立碗蘚萜類代謝基因工程中β-胡蘿卜素和萜類物質的積累。
【技術特征摘要】
1.一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因，其特征在于：它的核苷酸序列如序列表seqid?no:1所示。
2.一種牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因的編碼蛋白，其特征在于：它的氨基酸序列如序列表seq?id?no:2所示。
3.根據權利要求1或2所述的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶基因的編碼蛋白，其特征在于：牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合酶來源于小立碗蘚。
4.一種重組表達載體，其特征在于：包括權利要求1或2所述的牻牛兒基牻牛兒基二磷酸合...
【專利技術屬性】
技術研發人員：盧山，王林娟，劉心婭，梁瀚予，年佩雯，
申請(專利權)人：南京大學，
類型：發明
國別省市：
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