【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及應用微生物，具體涉及一種無性繁殖類絲狀真菌新功能基因的挖掘方法及其應用。
技術介紹
1、真菌包括酵母菌、霉菌和蕈菌(大型真菌)三大類，它們歸屬于真菌界的不同亞門，霉菌為絲狀真菌的統稱。近年來，隨著測序技術不斷的提高，絲狀真菌全基因組測序已經非常方便，基因功能的研究就逐漸成為真菌領域研究的熱點，但基因組注釋都是基于序列比對獲得，這種比對的前提是數據庫中須有已知功能基因；近十多年雖然基因敲出、rna干擾、超表達以及酵母雙雜交技術均已成功用于絲狀真菌基因功能的研究，但是這些研究也大部分都是依賴于已知功能的基因進行反向遺傳學的研究，原創性不強；不僅如此，絲狀真菌中大部分的基因功能及其與其他基因的功能耦合作用(即通過多基因敲出)還很不清楚。因此，從表型開始，挖局新功能基因是絲狀真菌研究領域最原創性的工作之一，然而，絕大部分絲狀真菌的繁殖是依靠菌絲體分化而形成的無性孢子(節孢子、厚垣孢子、孢囊孢子和分生孢子)進行的，很難通過像有性繁殖類生物一樣基于生物表型性狀進行雜交、回交以及基因功能回補等，來發現新功能基因，并解析與其他基因的功能耦合關系，這成為全世界絲狀真菌分子生物學研究的瓶頸。
技術實現思路
1、本專利技術的目的是為了解決上述問題，提供一種無性繁殖類絲狀真菌新功能基因的挖掘方法及其應用。
2、為了達到上述目的，本專利技術的技術方案如下：一種無性繁殖類絲狀真菌，所述無性繁殖類絲狀真菌為木霉野生菌株，所述木霉野生菌株的保藏編號：cgmcc?no.12166；保藏單位
3、本專利技術進一步公開了一種無性繁殖類絲狀真菌的新功能基因的挖掘方法，包括以下步驟：
4、s1、構建脲苷合成缺陷型但具有潮霉素抗性的木霉菌株a；
5、s2、獲取隨機突變株b，通過通過x射線照射野生型菌株并篩選出一株具有耐酸性能的隨機突變株b；
6、s3、原生質體制備與融合，通過原生質體融合方法構建暫時性擬似“二倍體”；所述暫時性擬似“二倍體”的兩套染色體分別來自木霉菌株a和隨機突變菌株b；
7、s4、篩選和表型驗證，通過核內的兩套染色體通過同源重組進行隨機突變子染色體基因隨機回補，并通過表型變化篩選獲得表型回補突變子；
8、s5、重測序與基因編輯驗證，利用重測序技術確定回補的關鍵突變位點并通過基因編輯方法反向驗證基因功能。
9、優選的，步驟s1中，所述木霉菌株a的構建是針對木霉脲苷合成關鍵基因ura3(a1a105144)進行以潮霉素為生物標記的基因敲除。
10、優選的，步驟s2中，所述隨機突變株b的獲取方法為：取200μl濃度為1×107的孢子懸液于96孔板后用x射線照射，照射后的孢子懸液稀釋涂布到所需條件的篩選培養基，篩選獲得表型發生顯著變化的突變株b。
11、優選的，所述x射線照射的總劑量為250gy，總照射三次，三次劑量分別為84gy、84gy和82gy。
12、優選的，所述原生質體融合的過程與驗證方法為：分別將木霉菌株a和隨機突變菌株b制備原生質體后利用peg介導的方法進行融合，利用含潮霉素的貧營養基篩選再生的轉化子后并進行單孢分離，去除異核體的轉化子，保留暫時性擬似“二倍體”，并利用特異性引物驗證。
13、優選的，所述原生質體融合方法是通過濃度逐漸降低的peg介導原生質體融合，具體過程為：9.5％peg+ca2+高滲溶液室溫5分鐘；7％peg+ca2+高滲溶液冰上5分鐘；5％peg+ca2+高滲溶液冰上20分鐘。
14、優選的，所述特異性引物包括：e-u3-f，e-hygb-r；e-u3-f，e-u3-r。
15、優選的，采用含有潮霉素b的基礎鹽葡萄糖培養基作為暫時性擬似“二倍體”篩選性培養基。
16、優選的，步驟s4中，采用基礎鹽葡萄糖培養基篩選目標功能基因發生回補的菌株。
17、優選的，步驟s5中，所述利用重測序技術確定回補的關鍵突變位點的具體過程為：將最后一次回補后表型發生變化的突變子c和初始突變株b在pda上培養后提取菌絲進行mapping分析，數據分析后比較二者的突變位點，回補菌株c的突變位點少于突變株b，這二者相差的突變位點即為關鍵基因的范圍。
18、與現有技術相比，本方案的有益效果：
19、1)本專利技術通過研究首次找到了無性繁殖類絲狀真菌木霉的隨機突變的適合劑量，x射線使無性繁殖類絲狀真菌孢子致死率達到99.9％的同時，利用最適合的培養基篩選突變子后并結合重測序技術實現了突變位點的檢測，進而建立了從表型到功能基因的實驗模型。
20、2)本專利技術通過構建脲苷合成缺陷型但具有潮霉素抗性的菌株a以及具有尿苷合成能力的隨機突變子b，利用功能互補的特性篩選原生質體融合的菌株，實現了融合菌株的篩選。
21、3)本專利技術首次利用暫時性擬似“二倍體菌株”不穩定性的特點導致染色體的自動分離從而實現染色體隨機回補后的回收。
22、4)本專利技術利用染色體隨機回補的特性，集中研究初始突變株和最后一次表型回補菌株；通過比較二者的突變位點找到功能基因的具體范圍后，利用基因編輯技術進一步驗證從而找到目的基因，該方法縮短了篩選目的基因的時間的同時也提高了篩選的準確性。
本文檔來自技高網...【技術保護點】
1.一種無性繁殖類絲狀真菌，其特征在于：所述無性繁殖類絲狀真菌為木霉野生菌株，所述木霉野生菌株的保藏編號：CGMCCNo.12166；保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心；保藏日期：2016年4月11日。
2.一種基于權利要求1所述的無性繁殖類絲狀真菌的新功能基因的挖掘方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟S1中，所述木霉菌株A的構建是針對木霉脲苷合成關鍵基因ura3(A1A105144)進行以潮霉素為生物標記的基因敲除。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟S2中，所述隨機突變株B的獲取方法為：取200μl濃度為1×107的孢子懸液于96孔板后用X射線照射，照射后的孢子懸液稀釋涂布到所需條件的篩選培養基，篩選獲得表型發生顯著變化的突變株B。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述X射線照射的總劑量為250Gy，總照射三次，三次劑量分別為84Gy、84Gy和82Gy。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟S3中，所述原生質體融合的過程與驗證方法為：
7.據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述原生質體融合方法是通過濃度逐漸降低的PEG介導原生質體融合，具體過程為：9.5％PEG+Ca2+高滲溶液室溫5分鐘；7％PEG+Ca2+高滲溶液冰上5分鐘；5％PEG+Ca2+高滲溶液冰上20分鐘。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述特異性引物包括：E-U3-F，E-hygb-R；E-U3-F，E-U3-R。
9.根據權利要求5所述的方法，其特征在于：采用含有潮霉素B的基礎鹽葡萄糖培養基作為暫時性擬似“二倍體”篩選性培養基。
10.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟S4中，采用基礎鹽葡萄糖培養基篩選目標功能基因發生回補的菌株。
11.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟S5中，所述利用重測序技術確定回補的關鍵突變位點的具體過程為：將最后一次回補后表型發生變化的突變子C和初始突變株B在PDA上培養后提取菌絲進行mapping分析，數據分析后比較二者的突變位點，回補菌株C的突變位點少于突變株B，這二者相差的突變位點即為關鍵基因的范圍。
12.根據權利要求2-11任意一項所述的方法在酸響應新功能基因挖掘中的應用。
...【技術特征摘要】
1.一種無性繁殖類絲狀真菌，其特征在于：所述無性繁殖類絲狀真菌為木霉野生菌株，所述木霉野生菌株的保藏編號：cgmccno.12166；保藏單位：中國普通微生物菌種保藏管理中心；保藏日期：2016年4月11日。
2.一種基于權利要求1所述的無性繁殖類絲狀真菌的新功能基因的挖掘方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟s1中，所述木霉菌株a的構建是針對木霉脲苷合成關鍵基因ura3(a1a105144)進行以潮霉素為生物標記的基因敲除。
4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟s2中，所述隨機突變株b的獲取方法為：取200μl濃度為1×107的孢子懸液于96孔板后用x射線照射，照射后的孢子懸液稀釋涂布到所需條件的篩選培養基，篩選獲得表型發生顯著變化的突變株b。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述x射線照射的總劑量為250gy，總照射三次，三次劑量分別為84gy、84gy和82gy。
6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：步驟s3中，所述原生質體融合的過程與驗證方法為：分別將木霉菌株a和隨機突變菌株b制備原生質體后利用peg介導的方法進行融合，利用含潮霉素的貧營養基篩選再生的轉化子后并進行單孢分離，去除...
【專利技術屬性】
技術研發人員：沈其榮，劉東陽，朱瀚，李托，劉洋，史曉騰，
申請(專利權)人：南京農業大學，
類型：發明
國別省市：
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