【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及熒光探針領域，具體涉及一種化合物、熒光團簇、免疫熒光團簇及其制備方法和應用。
技術介紹
1、免疫熒光染色技術是指利用熒光分子等發光劑對抗體進行標記后，借助熒光顯微鏡等儀器，對細胞等生物樣品的特征抗原進行定量分析或定位研究的技術，在微生物學、免疫學、病理學及免疫組織化學等領域具有重要意義。納米抗體(nanobody,nb)是一種來源于駝科動物的新型抗體，是目前具有完整抗原識別功能的最小分子片段。其相對分子質量為12-15kd，僅為傳統抗體的十分之一，可特異性地結合傳統抗體難以識別接近的細胞表面隱藏抗原，有助于實現高靈敏的免疫熒光染色。
2、納米抗體表面標記熒光分子的信號強度是決定其熒光成像的質量與分析結果的重要因素。傳統熒光分子依靠于特定的熒光基團發射熒光，在激發次數過多、激發時間過長時，其熒光團結構會發生不可逆變化，無法再發出熒光，導致光漂白現象，嚴重影響樣品熒光信號的分析。花菁型、吡咯硼型熒光分子具有一定的抗光漂白能力，但其疏水性較強，將其偶聯在小尺寸納米抗體表面時易引發抗體變性、失活。碳量子點、上轉換納米材料、稀土配合物等熒光材料具有良好的抗光漂白能力，但也存在各種不足，比如熒光信號不穩定、量子產率低、檢測成本高昂、制備過程復雜。
3、聚集誘導發光(aie，aggregation?induced?emission)材料是一種新型熒光材料，其特性在于通過可分子聚集的方式限制分子內部運動產生的熱能，進而促使光能輸出比例，從而產生熒光信號。aie材料聚集態產生的熒光信號具有穩定性好、抗光漂白能
4、專利技術人發現，只有當aie分子能在非有機溶劑依賴的反應環境中實現與納米抗體偶聯，才能真正實現aie分子在納米抗體免疫熒光染色應用。為達此目標，專利技術人嘗試探索如何解決具有疏水特性的aie分子與納米抗體偶聯時必須依賴有機溶劑環境的問題。諸如在水環境下實現偶聯，水環境如純水、磷酸鹽緩沖液(pbs)、2-(n-嗎啡啉)乙磺酸緩沖液(mes)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽緩沖液(tris)，則可避免有機試劑對納米抗體結構破壞，保證納米抗體活性，從而實現高靈敏的免疫熒光染色。
5、為實現上述在水環境下進行與納米抗體偶聯，專利技術人發現可通過將aie分子改性為完全水溶性，則可實現上述目的。文獻(acs?appl.mater.interfaces?2021,13,17,19625–19632)通過引入磺酸基(-so3)增加了四苯基乙烯的水溶性，雖提高了分子的親水性，但也無法實現其在100％純水溶劑中的溶解，不是完全水溶性的aie分子。因此，將其或者其團簇與納米抗體偶聯，仍必須在含有有機溶劑的反應環境中，將不能實現aie分子在納米抗體免疫熒光染色中應用。
技術實現思路
1、本專利技術為解決將aie分子或者其團簇與納米抗體偶聯而不使用有機溶劑作為反應環境，以在水環境實現，從而避免有機溶劑在偶聯中對納米抗體結構破壞的現象，避免該偶聯影響納米抗體活性，導致難以染色的問題。
2、為了實現上述目的，本專利技術第一方面提供一種化合物(utps2)，其中，所述化合物如式(ⅰ)所示：
3、
4、本專利技術第二方面提供一種化合物的制備方法，其中，包括以下步驟：
5、s110.將乙醇鈉及乙醇的混合溶液加入第一混合溶液中得第二混合溶液；
6、將1,4-丁磺酸內酯及乙醇的混合溶液加入所述第二混合溶液中進行第一反應；
7、再進行第一純化得第一中間產物，第一中間產物如式(ⅰⅰ)所示：
8、
9、其中，所述第一混合溶液為惰性氣氛下的[1,1-二(4-溴苯基)-2-二(4-羥基苯基)]乙烯及乙醇的混合溶液；
10、s120.將4-吡啶基硼酸、氫氧化鉀、四(三苯基膦)鈀加入所述第一中間產物及乙腈的混合溶液中進行第二反應；
11、再進行第二純化得第二中間產物，第二中間產物如式(ⅰⅰⅰ)所示：
12、
13、s130.惰性氣氛下將所述第二中間產物與5-氯甲基尿嘧啶溶解在n,n-二甲基甲酰胺中進行第三反應；
14、再進行第三純化后得上述第一方面所述的化合物。
15、本專利技術第三方面提供一種熒光團簇的制備方法，其中，包括將上述第一方面所述化合物、單鏈dna、溶劑進行混合制得所述熒光團簇。
16、本專利技術第四方面提供上述第三方面所述制備方法制得的熒光團簇(utps2/ssdna)。
17、本專利技術第五方面提供一種免疫熒光團簇的制備方法，其中，在所述水環境下將上述第四方面所述熒光團簇與納米抗體偶聯。
18、本專利技術第六方面提供上述第五方面所述制備方法制得的免疫熒光團簇(egfr?nb-utps2/ssdna)。
19、本專利技術第七方面提供上述第一方面所述化合物、上述第四方面所述熒光團簇或上述第六方面所述免疫熒光團簇在制備免疫熒光染色試劑上的應用。
20、相比于現有技術，本專利技術具有以下有益效果：
21、在第一方面上，本專利技術制備化合物utps2是一種具備完全水溶性的aie分子，由其制備的熒光團簇可在純水條件下與納米抗體偶聯，與現有技術的aie分子必須使用有機溶劑作為偶聯環境才能與納米偶聯相比，避免了有機試劑對納米抗體結構破壞的現象，從而避免降低納米抗體活性的問題，能夠真正實現aie分子用于免疫熒光染色。
22、在第二方面上，本專利技術制備化合物熒光發射峰與吸收峰之間存在較大斯托克斯位移，有利于提高熒光成像的信噪比。
23、在第三方面上，本專利技術利用a-u堿基互補配對的精準識別作用制備熒光團簇，提供的末端修飾的utps2/ssdna熒光團簇不僅具有完全的水溶性，且活性官能團明確可控，可以任意偶聯在目標抗體表面而不影響其活性，具有通用性。同時，其還具有熒光亮度高、抗光漂白能力強的優勢。
24、在第四方面上，本專利技術提供的nb-utps2/ssdna免疫熒光團簇在免疫熒光染色應用方面，具有具有水溶性好、抗光漂白、熒光信號穩定、簡便易得的優勢，從而實現靈敏、穩定的免疫熒光染色及分析。
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1.一種化合物，其特征在于，所述化合物如式(Ⅰ)所示：
2.一種化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，
4.根據權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，
5.根據權利要求2-4中任意一項所述的制備方法，其特征在于，
6.一種熒光團簇的制備方法，其特征在于，包括將權利要求1所述化合物、單鏈DNA、溶劑進行混合制得所述熒光團簇；
7.權利要求6所述制備方法制得的熒光團簇。
8.一種免疫熒光團簇的制備方法，其特征在于，在所述水環境下將權利要求7所述熒光團簇與納米抗體偶聯。
9.權利要求8所述制備方法制得的免疫熒光團簇。
10.權利要求1所述化合物、權利要求7所述熒光團簇或權利要求9所述免疫熒光團簇在制備免疫熒光染色試劑上的應用。
【技術特征摘要】
1.一種化合物，其特征在于，所述化合物如式(ⅰ)所示：
2.一種化合物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，
4.根據權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，
5.根據權利要求2-4中任意一項所述的制備方法，其特征在于，
6.一種熒光團簇的制備方法，其特征在于，包括將權利要求1所述化合物...
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