【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)屬于生物醫(yī)藥，具體涉及一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體及在制備asfv-p54納米顆粒中的應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、非洲豬瘟(african?swine?fever,asf)是由非洲豬瘟病毒(african?swine?fevervirus,asfv)感染引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。主要癥狀表現(xiàn)為高熱、皮膚發(fā)紺、淋巴結(jié)和內(nèi)臟器官嚴(yán)重出血，病死率高達(dá)100％，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)危害巨大。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(world?organization?for?animal?health,oie)將其列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物疫病。
2、馬克斯克魯維酵母(kluyveromyces?marxianus，km)是一種非常規(guī)酵母，與釀酒酵母(saccharomyces?cerevisiae)同屬于saccharomycetaceae科，是美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(f?ood?and?drug?administration，fda)的gras認(rèn)證(generally?recognized?as?safe，食品添加劑安全評(píng)價(jià))和歐盟食品安全局(european?food?safety?authority，簡(jiǎn)稱efsa)的qps認(rèn)證(qualified?presumption?of?safety，安全資格認(rèn)證)的安全酵母，也被中國(guó)衛(wèi)計(jì)委批準(zhǔn)為新食品原料。
3、申請(qǐng)人于2013年在湖北黃陂自然養(yǎng)殖土豬場(chǎng)成功分離出一株km-c2株(授權(quán)專利號(hào)：zl?103952324a)，并于2014年3月3
4、目前該菌株尚無(wú)可用于食用安全級(jí)別酵母表達(dá)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷篩選標(biāo)記及可以對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳改造的敲除載體。也沒(méi)有適用于該菌株的表達(dá)載體。鑒于此，本專利技術(shù)為該菌株建立適合的遺傳操作體系，實(shí)現(xiàn)在酵母基因組上的遺傳操作。為該菌株匹配不同的啟動(dòng)子-終止子組合及復(fù)制子組合，提供新型候選表達(dá)元件。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本專利技術(shù)的目的在于提供了一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32，為seq?id?no.2所示。
2、本專利技術(shù)的另一個(gè)目的在于提供了雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32在馬克斯克魯維酵母異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用，該應(yīng)用特別適用于非洲豬瘟亞單位疫苗的制備。
3、為了達(dá)到上述目的，本專利技術(shù)采取以下技術(shù)措施：
4、申請(qǐng)人通過(guò)篩選，組裝，制備了雙復(fù)制子表達(dá)載體，該載體在馬克斯克魯維酵母中實(shí)現(xiàn)了高轉(zhuǎn)化率和高表達(dá)效率的效果，具體如下：
5、一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32，為seq?id?no.2所示。
6、含有目的基因的雙復(fù)制子表達(dá)載體也屬于本專利技術(shù)的保護(hù)范圍。
7、一種重組營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母，是將上述雙復(fù)制子表達(dá)載體導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母中獲得，所述的營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母是將km-ko-ura3(seqi?d?no.1所示)導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母重獲得；
8、雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32在馬克斯克魯維酵母異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用；
9、雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32或重組營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母在制備亞單位疫苗中的應(yīng)用；
10、以上所述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，是制備非洲豬瘟亞單位疫苗。
11、以上所述的應(yīng)用中，優(yōu)選的，制備的為納米顆粒形式的asfv-p54蛋白口服疫苗，具體是將cap-linker-p54序列(seq?id?no.3所示)與雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32同源重組后，導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母中表達(dá)獲得。
12、以上所述的馬克斯克魯維酵母的保藏號(hào)為cctcc?no：m2014059。
13、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：
14、雙復(fù)制系統(tǒng)已成功用于質(zhì)粒的構(gòu)建，然而目前已有的雙復(fù)制子系統(tǒng)僅在穿梭質(zhì)粒中成功應(yīng)用，即兩種復(fù)制子分別屬于不同宿主。其目的在于可以允許質(zhì)粒在不同表達(dá)宿主中實(shí)現(xiàn)自我復(fù)制。如大腸桿菌和酵母、大腸桿菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞等，一般在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)擴(kuò)繁，繼而轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主中實(shí)現(xiàn)外源基因的表達(dá)。這種由雙復(fù)制子系統(tǒng)構(gòu)建的穿梭載體在不同宿主中僅有一個(gè)復(fù)制子發(fā)揮功能，因此兩種復(fù)制子一般不存在相互作用，也無(wú)法在同一宿主中將兩種復(fù)制子的復(fù)制特性所結(jié)合。
15、在本專利技術(shù)中，申請(qǐng)人創(chuàng)造性的將幾種優(yōu)選復(fù)制子進(jìn)行串聯(lián)，出現(xiàn)可以結(jié)合兩種復(fù)制子優(yōu)良表型的雙復(fù)制子系統(tǒng)。進(jìn)一步的，申請(qǐng)人利用本專利技術(shù)提供馬克斯克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)，成功表達(dá)納米顆粒形式的asfv-p54蛋白，為asfv口服免疫策略的研發(fā)提供新思路。
本文檔來(lái)自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護(hù)點(diǎn)】
1.?一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體pGKD32，為SEQ?ID?NO.2所示。
2.含有目的基因的權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體。
3.?一種重組營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母，所述的重組營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母是將權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母中獲得，所述的營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母是將SEQ?ID?NO.1所示敲除載體導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母重獲得。
4.權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體pGKD32在馬克斯克魯維酵母異源蛋白表達(dá)中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體pGKD32或權(quán)利要求3所述的重組營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母在制備亞單位疫苗中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，所述的亞單位疫苗為非洲豬瘟亞單位疫苗。
7.?根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，所述的非洲豬瘟亞單位疫苗為納米顆粒形式的ASFV-P54蛋白口服疫苗，具體是將SEQ?ID?NO.3所示的Cap-linker-P54序列與權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體pGKD32同源重組后，導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬
...【技術(shù)特征摘要】
1.?一種適用于馬克斯克魯維酵母的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32，為seq?id?no.2所示。
2.含有目的基因的權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體。
3.?一種重組營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母，所述的重組營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母是將權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體導(dǎo)入營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母中獲得，所述的營(yíng)養(yǎng)缺陷型馬克斯克魯維酵母是將seq?id?no.1所示敲除載體導(dǎo)入馬克斯克魯維酵母重獲得。
4.權(quán)利要求1所述的雙復(fù)制子表達(dá)載體pgkd32在馬克斯克魯維酵母異源蛋白表達(dá)中...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：金梅林，高朔，左文峰，黎晶晶，尚宵敏，康超，楊麗，孫小美，杭堯，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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