【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于生物，具體涉及一種萊茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗體及其制備方法和應用。
技術介紹
1、萊茵衣藻(chlamydomonas?reinhardtii)是實驗室研究中最常用的模式生物。這種單細胞真核綠藻，因其培養條件簡單、生長周期短、生長速度快、光合效率高而被稱為“光合酵母”。迄今為止，已經實現了對萊茵衣藻核基因組、葉綠體基因組和線粒體基因組的遺傳轉化。
2、纖毛是高度保守的細胞器，在細胞生物學中具有多種功能。纖毛復雜的超微結構與其多種作用一起進化，包括運動和傳感功能。盡管功能多樣，但仍存在一個普遍保留的結構核心，包括基于微管的軸絲，具有九軸對稱性。軸絲的結構和對稱性由其發出的母中心粒或基體決定。在基體正確錨定到質膜后，發育中的纖毛必須建立選擇性屏障來隔離對其構造至關重要的分子，因為它缺乏自主的翻譯機制。這個區域連接了基體和新生纖毛，被稱為過渡區(transition?zone，tz)。自20世紀50年代首次通過電子顯微鏡(em)觀察到tz以來，人們已經積累了大量知識來闡明這一關鍵纖毛區的結構和組成。值得注意的是，由于tz蛋白質突變導致的纖毛相關疾病(纖毛病)數量不斷增加，tz在科學研究中的重要性日益凸顯。萊茵衣藻是研究真核生物纖毛結構、功能與潛在分子機制的主要模式生物之一，被廣泛應用于細胞與分子生物學領域，并且作為纖毛疾病的研究模型。
3、nphp4基因編碼腎囊蛋白-4(nphp4)，定位于纖毛過渡區(tz)。nphp4是選擇性門控結構的重要組成部分，該門控結構在過渡區發揮作用，控制可溶性
技術實現思路
1、本專利技術提供了一種萊茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗體及其制備方法和應用，該多克隆抗體能特異性識別萊茵衣藻nphp4蛋白，可以用于研究纖毛過渡區定位標記；在生物研究領域的應用中可以通過免疫印跡wb法對萊茵衣藻細胞內nphp4蛋白進行定性與定量分析，還可以通過免疫熒光if法標記nphp4蛋白，以探究過渡區中各個蛋白的定位與相互關系，從而為萊茵衣藻為模式生物的纖毛表型變化以及纖毛門控運輸等相關調控機制的研究奠定應用基礎。
2、為了實現上述目的，本專利技術采用的技術方案如下：一種萊茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗體，所述多克隆抗體能夠特異性識別萊茵衣藻纖毛過渡區的nphp4蛋白；所述nphp4蛋白的氨基酸序列如序列表seq?id?no.1所示。
3、本專利技術還提供了一種上述的萊茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：
4、(1)利用生物信息學分析獲得nphp4蛋白中適合作為抗原片段的氨基酸序列，選定nphp4位于859-1058aa的cdna片段作為免疫抗原多肽，按照大腸桿菌的密碼子偏好性，進行全基因合成；所述nphp4位于859-1058aa的cdna片段如序列表seq?id?no.2所示，對應的氨基酸序列如序列表seq?id?no.3所示；
5、(2)利用步驟(1)合成的nphp4抗原cdna片段和原核細胞重組表達載體psumo，構建nphp4原核表達載體；
6、(3)將步驟(2)中構建好的nphp4原核表達載體轉化至bl21(de3)感受態細胞中，獲得重組表達菌株；
7、(4)以一定的條件誘導步驟(3)得到的重組表達菌株蛋白的表達，得到重組表達標簽nphp4抗原多肽；
8、(5)將步驟(4)誘導表達的nphp4抗原多肽作為抗原進行兔免疫處理，通過采血獲得nphp4蛋白兔多克隆抗血清，將抗血清親和純化，獲得nphp4蛋白的兔多克隆抗體。
9、進一步的，免疫處理方法為：將nphp4抗原多肽與等體積的完全弗氏佐劑混合，得到第一混合液并注射至免疫兔子體內；28天后，將nphp4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第二混合液并注射至所述免疫兔子體內；7天后，將nphp4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第三混合液并注射至所述免疫兔子體內；7天后，將nphp4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第四混合液并注射至所述免疫兔子體內；7天后，將nphp4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第五混合液并注射至所述免疫兔子體內；注射方法為背部多點注射；免疫量為：第一次主注射400μg抗原/只實驗兔，第二次到第五次均是注射125μg抗原/只實驗兔。
10、本專利技術還提供了一種上述萊茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗體在檢測萊茵衣藻nphp4蛋白方面中的應用。
11、進一步的，通過免疫熒光if方法或免疫印跡wb方法來檢測萊茵衣藻nphp4蛋白。
12、進一步的，通過免疫熒光if方法檢測萊茵衣藻nphp4蛋白的步驟如下：
13、將萊茵衣藻細胞以甲醇穿透法固定后，用pbs?buffer清洗3次，每次5min。用封閉液室溫封閉1h，用純化后的nphp4兔多克隆抗體以1:500稀釋比于4℃條件下過夜孵育；用含0.5％tween-20的pbs?buffer清洗3次，每次5min；用對應波長與種屬的熒光標記二抗在37℃孵育1h，再用含0.5％tween-20的pbs?buffer清洗3次，每次5min，然后使用不含tween-20的pbs?buffer清洗1次，最后使用ddh2o清洗一次，封片后在熒光顯微鏡下觀察nphp4蛋白在纖毛過渡區定位并拍照、作圖與分析。
14、進一步的，通過免疫印跡wb方法檢測萊茵衣藻nphp4蛋白的步驟如下：
15、將經過-80℃冷凍的衣藻細胞樣品用細胞裂解液反復吹打，并加入sds?buffer混勻后于95℃金屬浴10min；隨后進行sds-page電泳，其中濃縮膠電泳時間為20min、電壓為80v；分離膠電泳時間為80min、電壓為120v；進行轉膜，條件為80min、100v；將pvdf膜室溫封閉1h后用純化的nphp4兔多克隆抗體以1:5000稀釋比于4℃條件下過夜孵育；回收一抗，用1×tbst洗膜3次，每次10min；使用相對應的二抗室溫孵育1h，回收二抗，用1×tbst洗膜3次，隨后進行顯影，對nphp4蛋白進行定性以及定量分析。
16、與現有技術相比，本專利技術具有以下優點：
17、本專利技術利用萊茵衣藻nphp4表達載體免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體，所制備得到的多克隆抗體能特異性識別萊茵衣藻nphp4蛋白，其特點在于效價高和特異性好。生物研究領域的應用中可以通過免疫印跡wb法對萊茵衣藻細胞內nphp4蛋白進行定性與定量分析，還可以通過免疫熒光if法標記nphp4蛋白，以探究過渡區中各個蛋白的定位與相互關系，從而為萊茵衣藻為模式生物的纖毛表型變化、纖毛門控運輸以及纖毛疾病病理機制的深入探究，奠定應用基礎本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種萊茵衣藻NPHP4蛋白的兔多克隆抗體，其特征在于，所述多克隆抗體能夠特異性識別萊茵衣藻纖毛過渡區的NPHP4蛋白；所述NPHP4蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ?IDNO.1所示。
2.一種如權利要求1所述的萊茵衣藻NPHP4蛋白的兔多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種萊茵衣藻NPHP4蛋白的兔多克隆抗體的制備方法，其特征在于，免疫處理方法為：將NPHP4抗原多肽與等體積的完全弗氏佐劑混合，得到第一混合液并注射至免疫兔子體內；28天后，將NPHP4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第二混合液并注射至所述免疫兔子體內；7天后，將NPHP4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第三混合液并注射至所述免疫兔子體內；7天后，將NPHP4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第四混合液并注射至所述免疫兔子體內；7天后，將NPHP4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第五混合液并注射至所述免疫兔子體內；注射方法為背部多點注射；免疫量為：第一次主注射400μg抗原/只實驗兔，第二次到第五次均是注射12
4.如權利要求1所述的一種萊茵衣藻NPHP4蛋白的兔多克隆抗體在檢測萊茵衣藻NPHP4蛋白方面中的應用。
5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，通過免疫熒光IF方法或免疫印跡WB方法來檢測萊茵衣藻NPHP4蛋白。
6.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，通過免疫熒光IF方法檢測萊茵衣藻NPHP4蛋白的步驟如下：
7.根據權利要求5所述的應用，其特征在于，通過免疫印跡WB方法檢測萊茵衣藻NPHP4蛋白的步驟如下：
...【技術特征摘要】
1.一種萊茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗體，其特征在于，所述多克隆抗體能夠特異性識別萊茵衣藻纖毛過渡區的nphp4蛋白；所述nphp4蛋白的氨基酸序列如序列表seq?idno.1所示。
2.一種如權利要求1所述的萊茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的一種萊茵衣藻nphp4蛋白的兔多克隆抗體的制備方法，其特征在于，免疫處理方法為：將nphp4抗原多肽與等體積的完全弗氏佐劑混合，得到第一混合液并注射至免疫兔子體內；28天后，將nphp4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第二混合液并注射至所述免疫兔子體內；7天后，將nphp4抗原多肽與等體積的不完全弗氏佐劑混合，得到第三混合液并注射至所述免疫兔子體內；7天后，將nphp4抗原多肽與等體積的不完全...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王亮，徐闖，蔣林，李亞，王蘇慧，錢蘊瑤，吳怡瓊，董周舟，苗宸羽，
申請(專利權)人：江蘇師范大學，
類型：發明
國別省市：
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