【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及屬于分子生物學與臨床醫學領域，涉及一種雙分裂適體探針及其應用。
技術介紹
1、夾心免疫測定法是一種通用的檢測方法，其檢出限低、特異性高，具有廣泛的應用前景。但是這種測定方法要求分析物至少具有兩個可以同時結合兩種抗體的表位。然而，由于尺寸有限，小分子通常被認為是單價的，無法同時結合兩種抗體。因此，夾心免疫分析大多是用來檢測蛋白質等大分子，而很難對分子量小于1000的小靶標進行檢測。與抗體相比，適體具有分子質量小、分子修飾靈活、可在室溫下長期保存、變性和復性后可重復使用等優點，為克服抗體的局限性提供了可能性，在小分子檢測的特殊情況下，適體相對于抗體具有更大的優勢，被認為是抗體的有前途的替代品。適體識別是基于分子間作用力，例如靜電相互作用、氫鍵等，對小分子有很強的親和力和選擇性。但是適體由于其核苷酸序列過長，往往傾向于折疊成非特異的二級結構，可能與其他物質結合，產生假陽性或非特異性信號，這顯然不利于建立一個特異性強的檢測方法。其次，傳統的小分子適體只有一個結合表位甚至部分表位，這給設計同時具有捕獲功能和信號報告的夾心式傳感器帶來了挑戰。
2、為了解決上述完整適體的難點，提高適體的特異性和敏感性。科學家提出了分離式適體的概念，即創造性地將一個完整的適體分成兩個片段。分裂適體比完整適體序列更短，可以避免空間位阻的缺點。并且分裂適體由于缺乏二級結構，在沒有靶標存在時會分散，只有在靶標存在時，適體才能夠重新組裝成與之特異性結合的完整復合物，這種技術能夠有效地避免假陽性或非特異性信號的產生。例如白云峰等人首次借助分裂適
3、與線性hcr相比，非線性雜交鏈式反應(nhcr)由于形成分支納米結構而具有更高的擴增效率，并且簡化了無酶操作。楊甜甜等人成功利用了適體鄰近雜交的特異性優勢以及nhcr的高靈敏度開發了一種共定位觸發的dna納米組裝策略用于放大成像(qi?c,bingt,mei?h,et?al.g-quadruplex?aptamers?for?zeatin?recognizing[j].biosensors?andbioelectronics,2013.299(13):157-162.)。該方法在確保特異性的同時保證了更高的檢測靈敏度。
4、細胞外三磷酸腺苷(atp)和ade等ade衍生物因其在腫瘤間質中的高濃度水平成為公認的癌癥生化標志物。在正常生理條件下細胞外atp水平處于低nm水平，但在腫瘤基質和附近區域增加至μm水平。癌細胞會整合激活(atp)和抑制(ade)信號通路，從而產生“最終”的ade衍生物濃度結果。ade作為人類腫瘤標志物在正常人與癌癥患者體內含量的差異。如ade在人體內的正常含量為0.18μm-4.7μm，結直腸癌患者中的ade濃度是健康人的近3倍。然而，目前市售的ade衍生物檢測試劑盒的檢測限僅為微克級別，其檢測靈敏度無法滿足癌癥臨床監測的需求，并且多是酶聯免疫檢測，操作過程復雜，需要嚴格控制實驗環境。
技術實現思路
1、本專利技術的目的在于構建一種高靈敏度的雙分裂適體探針及其應用。
2、為了實現上述目的，本專利技術的技術方案如下：
3、一種雙分裂適體探針，包括兩個分裂適體，分別為分裂適體1和分裂適體2，分裂適體1包括適體片段1和分裂引發劑1，分裂適體2包括適體片段2和分裂引發劑2，兩個適體片段來自一個完整的適體序列a；所述適體片段1和適體片段2具有識別目的靶標的能力，所述分裂引發劑1和分裂引發劑2具有啟動nhcr的功能。
4、該探針能夠特異性識別靶標，在靶標存在的情況下，探針能夠形成三明治結構，使兩段相互獨立的引發劑彼此靠近，協同誘導非線性雜交鏈反應(nonlinear?hybridizationchain?reaction，nhcr)，實現微量小分子檢測信號的二次或指數生長。與典型的nhcr的引發劑是完整的不同，本專利技術中的引發劑被分成兩部分，可以由ade共同誘導。因此，在沒有ade的情況下，它可以被有效地抑制。首先，可以通過將完整的適體序列切割成兩個片段來構建分裂適體，然后與nhcr方法結合，以構建簡便且通用的小分子檢測平臺。雙分裂適體探針由兩個序列組成，每個序列可以細分為具有不同功能的兩個片段，一個片段源自分裂適體，具有識別ade的能力，另一片段源自分裂引發劑以啟動nhcr。在游離狀態下，兩個序列彼此分開，單獨的分裂引發劑不能啟動nhcr，從而留下具有猝滅熒光的穩定探針。但在ade存在的情況下，兩條分裂適體可以結合兩分子的ade，并根據“誘導契合效應”重新組裝成特定的構型。然后，雙分裂適體探針的識別驅動重塑可以將兩段分裂引發劑拉近，作為完整的引發劑觸發nhcr過程。
5、在其中的一個優選的實施例中，分裂適體1和分裂適體2的摩爾比例為1-2:1-2。
6、在其中的一個優選的實施例中，所述適體片段2的序列如acctgggggagtat；分裂引發劑2的序列為gatcaagcagt；適體片段1的序列如tgcggaggaaggt；分裂引發劑1的序列為gtcgaagtagtt；適體序列a的序列為acctgggggagtattgcggaggaaggt。
7、分裂引發劑和適體片段之間不能相互干擾。
8、本專利技術還要求保護所述雙分裂適體探針在制備檢測腺苷或腺苷衍生物的試劑或試劑盒中的應用。
9、本發還要求保護所述雙分裂適體探針在制備檢測結直腸癌、前列腺癌或肺癌的試劑或試劑盒中的應用。
10、一種檢測腺苷或腺苷衍生物的試劑或試劑盒，每一份檢測量包括10μl?at1溶液，10μl?at2溶液，16.5μl?buffer，1μl?fa溶液，1μl?fb溶液，1.5μl?qa溶液，3μl?qb溶液，2μlaa溶液和4μl?ab溶液；
11、所述at1的序列如seq?id?no.1所示，所述at2的序列如seq?id?no.2所示，所述fa的序列如seq?id?no.3所示，所述fb的序列如seq?id?no.4所示，所述qa的序列如seq?idno.5所示，所述qb的序列如seq?id?no.6所示，所述aa的序列如seq?id?no.7-11所示，所述ab的序列如seq?id?no.12所示。
12、一種檢測結直腸癌、前列腺癌或肺癌的試劑或試劑盒，每一份檢測量包括10μlat1溶液，10μl?at2溶液，16.5μl?buffer，1μl?fa溶液，1μl?本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種雙分裂適體探針，其特征在于，包括兩個分裂適體，分別為分裂適體1和分裂適體2，分裂適體1包括適體片段1和分裂引發劑1，分裂適體2包括適體片段2和分裂引發劑2，兩個適體片段來自一個完整的適體序列A；所述適體片段1和適體片段2具有識別目的靶標的能力，所述分裂引發劑1和分裂引發劑2具有啟動NHCR的功能。
2.根據權利要求1所述的雙分裂適體探針，其特征在于，所述分裂適體1和分裂適體2的摩爾比例為1-2:1-2。
3.根據權利要求1所述的雙分裂適體探針，其特征在于，所述適體片段2的序列如ACCTGGGGGAGTAT；分裂引發劑2的序列為GATCAAGCAGT；適體片段1的序列如TGCGGAGGAAGGT；分裂引發劑1的序列為GTCGAAGTAGTT；
4.根據權利要求1-3所述的雙分裂適體探針在制備檢測腺苷或腺苷衍生物的試劑或試劑盒中的應用。
5.根據權利要求1-3所述的雙分裂適體探針在制備檢測結直腸癌、前列腺癌或肺癌的試劑或試劑盒中的應用。
6.一種檢測腺苷或腺苷衍生物的試劑或試劑盒，其特征在于，每一份檢測量包括10μL
7.一種檢測結直腸癌、前列腺癌或肺癌的試劑或試劑盒，其特征在于，每一份檢測量包括10μL?AT1溶液，10μL?AT2溶液，16.5μL?buffer，1μL?FA溶液，1μLFB溶液，1.5μL?QA溶液，3μL?QB溶液，2μL?AA溶液和4μL?AB溶液；所述AT1的序列如SEQ?ID?NO.1所示，所述AT2的序列如SEQ?ID?NO.2所示，所述FA的序列如SEQ?ID?NO.3所示，所述FB的序列如SEQ?ID?NO.4所示，所述QA的序列如SEQ?ID?NO.5所示，所述QB的序列如SEQ?ID?NO.6所示，所述AA的序列如SEQ?ID?NO.7-11所示，所述AB的序列如SEQ?ID?NO.12所示。
8.根據權利要求6或者7所述的試劑盒，其特征在于，所述AA的序列如SEQ?ID?NO.8所示。
...【技術特征摘要】
1.一種雙分裂適體探針，其特征在于，包括兩個分裂適體，分別為分裂適體1和分裂適體2，分裂適體1包括適體片段1和分裂引發劑1，分裂適體2包括適體片段2和分裂引發劑2，兩個適體片段來自一個完整的適體序列a；所述適體片段1和適體片段2具有識別目的靶標的能力，所述分裂引發劑1和分裂引發劑2具有啟動nhcr的功能。
2.根據權利要求1所述的雙分裂適體探針，其特征在于，所述分裂適體1和分裂適體2的摩爾比例為1-2:1-2。
3.根據權利要求1所述的雙分裂適體探針，其特征在于，所述適體片段2的序列如acctgggggagtat；分裂引發劑2的序列為gatcaagcagt；適體片段1的序列如tgcggaggaaggt；分裂引發劑1的序列為gtcgaagtagtt；
4.根據權利要求1-3所述的雙分裂適體探針在制備檢測腺苷或腺苷衍生物的試劑或試劑盒中的應用。
5.根據權利要求1-3所述的雙分裂適體探針在制備檢測結直腸癌、前列腺癌或肺癌的試劑或試劑盒中的應用。
6.一...
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