【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及干細胞，尤其涉及一種提高gmp體系下臍帶間充質干細胞成骨分化的方法。
技術介紹
1、間充質干細胞(mesenchymal?stem?cell，mscs)，是一種具有自我更新和多向分化潛能的成體干細胞，主要存在于結締組織和器官間質中，如骨髓、血液、臍帶、臍血、胎盤、脂肪等，具有調節炎癥，抗凋亡和促血管生成的特性，是再生醫學，炎癥性疾病、高通量篩選和毒理學的優秀工具。它們在適當的誘導條件下可以分化為成骨細胞。人臍帶間充質干細胞(uc-mscs)可以非侵入性收獲，具有成骨分化和良好的增殖能力，低免疫原性和強免疫抑制能力，使它們在臨床醫學和骨組織工程方面有較廣闊的前景。
2、mscs的成骨分化是鑒定mscs具有成骨能力的重要證據，是骨組織工程的基礎。在成骨分化的過程中，成骨細胞首先合成1型膠原蛋白，骨鈣素和骨橋蛋白等細胞外基質，通過小泡釋放鈣離子和堿性磷酸酶等酶類物質，鈣離子在堿性磷酸酶的作用下沉積在膠原纖維絲上，完成細胞外基質礦物化過程，最終形成骨組織。礦化結節也叫骨結節是骨成熟的標志，也是骨組織行使功能的形態特征；而鈣結節的形成則通過茜素紅染色來鑒定。
3、隨著科技的發展，干細胞作為一種細胞生物制劑來研究和生產已成為趨勢。細胞生物制劑需符合《藥品生產質量管理規范》(good?manufacturing?practice?of?medicalproducts，gmp)，生產細胞需使用不含動物源性物質的無血清培養基，同時添加成分明確的促生長的細胞添加劑，使用這種培養基培養的細胞和有血清培養基相比擴增
技術實現思路
1、鑒于上述的分析，本專利技術實施例旨在提供一種提高gmp體系來源的臍帶間充質干細胞向成骨分化的方法，用以解決現有誘導方法對gmp體系下無血清培養生產的人臍帶間充質干細胞(uc-mscs)成骨誘導效果很差的問題。
2、本專利技術的目的主要是通過以下方案實現的：
3、本專利技術提供了一種提高gmp體系下臍帶間充質干細胞成骨分化的方法，包括以下步驟：
4、s1：復蘇細胞；
5、s2：細胞達到第一融合度時，用trypletmselect酶消化細胞，然后用磷酸鹽緩沖液終止消化反應；
6、s3：將消化后的細胞懸液轉移到尖底無菌離心管中，離心處理；
7、s4：棄去上清，用臍帶間充質干細胞無血清培養基重懸細胞并計數；
8、s5：對細胞培養皿進行包被處理；
9、s6：將細胞接種至包被處理的多孔板中，每孔加入臍帶間充質干細胞無血清培養基，放置于培養箱中對細胞進行培養；
10、s7：細胞達到第二融合度時，棄去臍帶間充質干細胞無血清培養基，每孔加入msc成骨誘導完全培養基，繼續放置于培養箱中對細胞進行培養；
11、s8：第一誘導期，補加msc成骨誘導完全培養基，繼續放置于培養箱中對細胞進行培養；
12、s9：第二誘導期，補加msc成骨誘導完全培養基，繼續放置于培養箱中對細胞進行培養；
13、s10：第三誘導期，觀察培養基中和細胞表面鈣沉積和骨結節的形成情況，根據評價規則，判斷是否停止誘導培養；
14、s11：誘導培養結束后，棄去培養上清，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞兩次，每孔加入中性多聚甲醛溶液，室溫固定細胞；
15、s12：棄去固定液，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞兩次，室溫下每孔加入茜素紅染液對細胞進行染色；
16、s13：棄去茜素紅染液，用磷酸鹽緩沖液清洗細胞三次，添加新鮮pbs，顯微鏡下觀察細胞表面的骨結節和鈣沉積，對細胞表面的骨結節和鈣沉積進行定量分析。
17、進一步地，步驟s2中，所述第一細胞融合度為90-95％。
18、進一步地，步驟s7中，所述第二細胞融合度為60-70％。
19、進一步地，步驟s8中，所述第一誘導期為誘導開始第5-7天；
20、進一步地，步驟s8中，所述補加msc成骨誘導完全培養基的量為300?-600μl/孔。
21、進一步地，步驟s9中，所述第二誘導期為誘導開始第10-14天。
22、進一步地，步驟s9中，所述補加msc成骨誘導完全培養基的量為300-600μl/孔。
23、進一步地，步驟s10中，所述第三誘導期為誘導開始第15-21天。
24、進一步地，步驟s10中，所述評價規則包括：
25、細胞表面鈣沉積點＜5個且培養基中骨結節＞50個，則從培養基上層吸走500-1000μl培養基；
26、細胞表面鈣沉積點＜5個且培養基中骨結節＜50個，則從培養基上層吸走500-1000μl培養基，并每孔補充msc成骨誘導完全培養基繼續觀察5-10天；
27、細胞表面鈣沉積點＞50個，停止細胞誘導培養。
28、進一步地，所述補充msc成骨誘導完全培養基的量為300-600μl/孔。
29、與現有技術相比，本專利技術至少可實現如下有益效果之一：
30、1、與傳統的頻繁更換msc成骨誘導完全培養基進行成骨誘導的方法相比，本專利技術根據誘導周期，在誘導初期補充msc成骨誘導完全培養基的操作方法，通過合理的更換頻次和體積設定，既能滿足細胞營養的需求，又不至于使得培養基中的營養過于豐富，有利于人臍帶間充質干細胞的成骨分化；同時，人臍帶間充質干細胞在成骨分化過程中會分泌促進成骨分化的細胞因子，頻繁更換msc成骨誘導完全培養基容易丟失這些促進成骨分化的細胞因子，本專利技術通過在誘導初期補充msc成骨誘導完全培養基的操作方法，可以使得細胞成骨分化過程中分泌的有利于分化的細胞因子累積，進一步促進細胞成骨分化，提高了人臍帶間充質干細胞的成骨分化的效率和效果。
31、2、本專利技術通過使用常規的msc成骨誘導完全培養基，通過合理的更換頻次和體積設定，在誘導初期補充msc成骨誘導完全培養基的操作方法，提高了人臍帶間充質干細胞的成骨能力。
32、3、本專利技術的人臍帶間充質干細胞成骨分化的方法同樣適用于gmp體系下其他來源的間充質干細胞成骨的誘導，包括但不限于脂肪間充質干細胞，胎盤間充質干細胞，骨髓間充質干細胞，羊膜間充質干細胞，血液間充質干細胞等。本專利技術方法可用于間充質干細胞的體外成骨分化的鑒定，基于間充質干細胞的骨組織工程中骨組織體外誘導的探究。
33、本專利技術中，上述各技術方案之間還可以相互組合，以實現更多的優選組合方案。本專利技術的其他特征和優點將在隨后的說明書中闡述，并且，部分優點可從說明書中變得顯而易見，或者通過實施本專利技術而了解。本專利技術的目的和其他優點可通本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種提高GMP體系下臍帶間充質干細胞成骨分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2中，所述第一細胞融合度為90-95％。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S7中，所述第二細胞融合度為60-70％。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S8中，所述第一誘導期為誘導開始第5-7天。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟S8中，所述補加MSC成骨誘導完全培養基的量為300-600μL/孔。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟S9中，所述第二誘導期為誘導開始第10-14天。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟S9中，所述補加MSC成骨誘導完全培養基的量為300-600μL/孔。
8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S10中，所述第三誘導期為誘導開始第15-21天。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟S10中，所述評價規則包括：
10.根據權利要求9所述
...【技術特征摘要】
1.一種提高gmp體系下臍帶間充質干細胞成骨分化的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟s2中，所述第一細胞融合度為90-95％。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟s7中，所述第二細胞融合度為60-70％。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟s8中，所述第一誘導期為誘導開始第5-7天。
5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟s8中，所述補加msc成骨誘導完全培養基的量為300-600μl/孔。
6....
【專利技術屬性】
技術研發人員：王海方，劉慧，于洋，
申請(專利權)人：北京大學第三醫院北京大學第三臨床醫學院，
類型：發明
國別省市：
還沒有人留言評論。發表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。