【技術(shù)實(shí)現(xiàn)步驟摘要】
本申請(qǐng)涉及分子生物學(xué)，特別是涉及一種用于單基因遺傳病相關(guān)基因檢測(cè)的文庫(kù)構(gòu)建方法、核酸產(chǎn)品及試劑盒。
技術(shù)介紹
1、單基因遺傳病是指由某種特定基因的突變引起的疾病。這些基因突變可以遺傳給后代，導(dǎo)致患上相同的疾病或癥狀。單基因遺傳病可根據(jù)遺傳模式細(xì)分為常染色體顯性遺傳，如軟骨發(fā)育不全；常染色體隱性遺傳，如耳聾；x連鎖顯性遺傳病、如x連鎖智力障礙；x連鎖隱性遺傳病，如杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良癥；y連鎖遺傳病，如無(wú)精子癥。目前已知單基因病有9000多種，其綜合發(fā)病率高于1/100，多數(shù)單基因病致畸、致殘、致死，僅5％有有效藥物，且費(fèi)用昂貴。
2、目前可用于單基因遺傳病檢測(cè)的技術(shù)有sanger測(cè)序、毛細(xì)管電泳和高通量測(cè)序。其中，sanger測(cè)序的通量有限，適合檢測(cè)已知基因的變異，常作為致病基因或致病位點(diǎn)明確的單基因遺傳病的檢測(cè)手段或作為高通量測(cè)序的驗(yàn)證技術(shù)；毛細(xì)管電泳主要針對(duì)已明確由短串聯(lián)重復(fù)序列數(shù)目異常引起的單基因遺傳病；而高通量測(cè)序?qū)δ繕?biāo)區(qū)域或基因靶向檢測(cè)主要采取的方式是：雜交捕獲(液相和固相)和多重pcr。雜交捕獲能夠?qū)Ω蟮哪繕?biāo)區(qū)域進(jìn)行捕獲，基于探針的雜交捕獲技術(shù)較容易對(duì)探針進(jìn)行優(yōu)化，從而獲得較好的均一性，對(duì)多種變異類型具有較好的兼容性，因此基于探針的雜交捕獲技術(shù)適用于較大的基因panel，液相雜交捕獲測(cè)序可適用于幾kb到上百mb的基因組目標(biāo)區(qū)域的檢測(cè)，可檢測(cè)snv，indel，cnv等變異。但是液相捕獲存在實(shí)驗(yàn)操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、gc/at高含量區(qū)覆蓋度低等問題，而且針對(duì)單一疾病或幾個(gè)基因的檢測(cè)相對(duì)而言成本較高；且基于液相雜
3、因此，亟需一種能對(duì)單基因遺傳病相關(guān)基因突變進(jìn)行高效準(zhǔn)確檢出的相關(guān)技術(shù)和產(chǎn)品。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、基于此，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N用于單基因遺傳病相關(guān)基因檢測(cè)的文庫(kù)構(gòu)建方法、核酸產(chǎn)品及試劑盒，可用于同時(shí)檢測(cè)多種單基因遺傳病，且具有高靈敏度、高通量、低成本。
2、根據(jù)本申請(qǐng)第一方面，提供了一種用于檢測(cè)單基因遺傳病相關(guān)基因突變的核酸產(chǎn)品，包括用于擴(kuò)增atp7b基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增g6pd基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增hbb基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增pah基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增mmachc基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增slc26a4基因的長(zhǎng)鏈pcr引物和用于擴(kuò)增gjb2基因的長(zhǎng)鏈pcr引物中的至少一種。
3、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述用于擴(kuò)增atp7b基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:1～10所示，所述用于擴(kuò)增g6pd基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:11～14所示，所述用于擴(kuò)增hbb基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:15～16所示，所述用于擴(kuò)增pah基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:17～28所示，所述用于擴(kuò)增mmachc基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:29～32所示，所述用于擴(kuò)增slc26a4基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:33～42所示，所述用于擴(kuò)增gjb2基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:43～44所示。
4、本申請(qǐng)的第二方面提供了上述的核酸產(chǎn)品在制備單基因遺傳病的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
5、本申請(qǐng)的第三方面提供了一種用于檢測(cè)單基因遺傳病的試劑盒，所述試劑盒包括上述的核酸產(chǎn)品。
6、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒還包括pcr反應(yīng)試劑。
7、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述pcr反應(yīng)試劑包括pcr緩沖液、dna聚合酶、鎂離子和dntps中的一種或多種。
8、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述試劑盒還包括dna提取試劑。
9、本申請(qǐng)的第四方面提供了一種用于單基因遺傳病相關(guān)基因檢測(cè)的文庫(kù)構(gòu)建方法，包括以下步驟：
10、提取待測(cè)生物樣本的基因組dna；
11、以所述基因組dna為模板，采用上述的核酸產(chǎn)品進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到第一擴(kuò)增產(chǎn)物；
12、以所述第一擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二pcr擴(kuò)增，制得第二擴(kuò)增產(chǎn)物；以及
13、根據(jù)所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建所述用于檢測(cè)單基因遺傳病相關(guān)基因檢測(cè)的文庫(kù)；
14、所述第二pcr擴(kuò)增所用的引物包括通用引物和特異性引物中的至少一種。
15、在其中一個(gè)實(shí)施例中，制得第二擴(kuò)增產(chǎn)物后，對(duì)所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，取純化后的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢，取質(zhì)檢通過(guò)的產(chǎn)物構(gòu)建所述單基因遺傳病相關(guān)基因的基因文庫(kù)。
16、在其中一個(gè)實(shí)施例中，所述第一pcr擴(kuò)增的條件包括：94℃～96℃反應(yīng)1min～3min，96℃～98℃反應(yīng)10s～30s，65℃～70℃反應(yīng)1min～8min，循環(huán)30次～40次。
17、本申請(qǐng)同時(shí)對(duì)單基因遺傳病7個(gè)致病基因：atp7b、g6pd、hbb、pah、mmachc、slc26a4和gjb2基因進(jìn)行捕獲建庫(kù)。本申請(qǐng)用于檢測(cè)單基因遺傳病相關(guān)基因突變的核酸產(chǎn)品可以和atp7b基因、g6pd基因、hbb基因、pah基因、mmachc基因、slc26a4基因和gjb2基因靶核酸序列更特異性、更靈敏、更準(zhǔn)確的結(jié)合，既可以檢測(cè)cds區(qū)和剪切區(qū)相關(guān)變異，也可以檢測(cè)深度內(nèi)含子區(qū)和utr區(qū)相關(guān)變異，還可以進(jìn)行包含在擴(kuò)增子里面外顯子的缺失檢測(cè)，同時(shí)也大幅降低了引物間交叉擴(kuò)增、配對(duì)、競(jìng)爭(zhēng)性擴(kuò)增以及擴(kuò)增不均一等問題，更好地解決高gc/at區(qū)域富集的問題。
18、利用pcr反應(yīng)在待測(cè)dna片段兩端加上接頭的方法，采用兩輪pcr反應(yīng)成功構(gòu)建單基因遺傳病相關(guān)基因檢測(cè)的文庫(kù)，具有文庫(kù)構(gòu)建周期短，比對(duì)率高，均一性好，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可以為臨床醫(yī)生綜合評(píng)估受檢者的患病風(fēng)險(xiǎn)、定制個(gè)性化醫(yī)療和生活干預(yù)措施，以期顯著降低單基因遺傳病的風(fēng)險(xiǎn)提供指導(dǎo)。
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1.一種用于檢測(cè)單基因遺傳病相關(guān)基因突變的核酸產(chǎn)品，其特征在于，包括用于擴(kuò)增ATP7B基因的長(zhǎng)鏈PCR引物、用于擴(kuò)增G6PD基因的長(zhǎng)鏈PCR引物、用于擴(kuò)增HBB基因的長(zhǎng)鏈PCR引物、用于擴(kuò)增PAH基因的長(zhǎng)鏈PCR引物、用于擴(kuò)增MMACHC基因的長(zhǎng)鏈PCR引物、用于擴(kuò)增SLC26A4基因的長(zhǎng)鏈PCR引物和用于擴(kuò)增GJB2基因的長(zhǎng)鏈PCR引物中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)單基因遺傳病相關(guān)基因突變的核酸產(chǎn)品，其特征在于，所述用于擴(kuò)增ATP7B基因的長(zhǎng)鏈PCR引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:1～10所示，所述用于擴(kuò)增G6PD基因的長(zhǎng)鏈PCR引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:11～14所示，所述用于擴(kuò)增HBB基因的長(zhǎng)鏈PCR引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:15～16所示，所述用于擴(kuò)增PAH基因的長(zhǎng)鏈PCR引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:17～28所示，所述用于擴(kuò)增MMACHC基因的長(zhǎng)鏈PCR引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:29～32所示，所述用于擴(kuò)增SLC26A4基因的長(zhǎng)鏈PCR引物的核苷酸序列如SEQ?ID?NO:33～42所示，
3.權(quán)利要求1或2所述的核酸產(chǎn)品在制備單基因遺傳病的檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種用于檢測(cè)單基因遺傳病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括權(quán)利要求1～2任一項(xiàng)所述的核酸產(chǎn)品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于檢測(cè)單基因遺傳病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR反應(yīng)試劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測(cè)單基因遺傳病的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)試劑包括PCR緩沖液、DNA聚合酶、鎂離子和dNTPs中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求4～6任一項(xiàng)所述的用于檢測(cè)單基因遺傳病的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括DNA提取試劑。
8.一種用于單基因遺傳病相關(guān)基因檢測(cè)的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，制得第二擴(kuò)增產(chǎn)物后，對(duì)所述第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，取純化后的產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)檢，取質(zhì)檢通過(guò)的產(chǎn)物構(gòu)建所述單基因遺傳病相關(guān)基因的基因文庫(kù)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8～9任一項(xiàng)所述的文庫(kù)構(gòu)建方法，其特征在于，所述第一PCR擴(kuò)增的條件包括：94℃～96℃反應(yīng)1min～3min，96℃～98℃反應(yīng)10s～30s，65℃～70℃反應(yīng)1min～8min，循環(huán)30次～40次。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種用于檢測(cè)單基因遺傳病相關(guān)基因突變的核酸產(chǎn)品，其特征在于，包括用于擴(kuò)增atp7b基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增g6pd基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增hbb基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增pah基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增mmachc基因的長(zhǎng)鏈pcr引物、用于擴(kuò)增slc26a4基因的長(zhǎng)鏈pcr引物和用于擴(kuò)增gjb2基因的長(zhǎng)鏈pcr引物中的至少一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測(cè)單基因遺傳病相關(guān)基因突變的核酸產(chǎn)品，其特征在于，所述用于擴(kuò)增atp7b基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:1～10所示，所述用于擴(kuò)增g6pd基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:11～14所示，所述用于擴(kuò)增hbb基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:15～16所示，所述用于擴(kuò)增pah基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:17～28所示，所述用于擴(kuò)增mmachc基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:29～32所示，所述用于擴(kuò)增slc26a4基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:33～42所示，所述用于擴(kuò)增gjb2基因的長(zhǎng)鏈pcr引物的核苷酸序列如seq?id?no:43～44所示。
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【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：張向東，趙亞涵，汪利，胡琴，楊祖，
申請(qǐng)(專利權(quán))人：蘇州貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室有限公司，
類型：發(fā)明
國(guó)別省市：
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