【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及基因工程，具體涉及一種嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s及其用途。
技術介紹
1、幾丁質又可以叫殼多糖、甲殼素、甲殼質、聚乙酰氨基葡糖，由n-乙酰-d-氨基葡萄糖(n-acetyl-d-glucosamine)通過β-1,4糖苷鍵連接而成，其廣泛存在于海洋甲殼動物外殼、軟體動物內骨骼、昆蟲翅膀、及藻類細胞壁內。幾丁質是一類重要的多糖，具有廣泛的應用價值，在自然界中的儲存量巨大，屬于第二大類天然高分子化合物，僅次于纖維素。
2、β-n-乙酰-d-氨基葡萄糖苷酶(glcnacases，β-n-acetyl-d-glucosaminidases，ec3.2.1.52)能夠水解含n-乙酰氨基葡萄糖的低聚糖和蛋白質(zhang?et?al.applmicrobiol?biot,2018,102(1):93–103)。內切幾丁質酶將幾丁質水解生成殼寡糖，β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶可進一步水解殼寡糖生成n-乙酰氨基葡萄糖(glcnac)。glcnac可應用于功能性食品、能源及化妝品等領域。
3、β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶在低溫環境下活性較低，極大地限制了它的使用。嗜冷酶在0℃仍有活性，能在低溫要求的生物
表現出強活性，同時能提高溫度以溫和的條件使酶失活而控制工業生產過程；嗜鹽酶可應用于海產品加工等領域，在高鹽環境下加工食品還可以防止微生物的污染、節省滅菌等所消耗的能源，其受鹽激活的特點也有利于通過調整鹽濃度來控制催化反應。因此，開發出一種耐鹽嗜鹽的β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶有利于
技術實現思路
1、本專利技術的目的是提供一種嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體，具有更低的最適溫度，為能更好的應用于低溫含鹽環境要求下的生物
中。
2、為了達到上述目的，本專利技術提供了一種嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s，該突變體d180s的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，該突變體d180s在0℃有78.41％的酶活，其活性可以被鹵素鹽和nano3激活。本專利技術提供的突變體d180s可被應用與低溫含鹽環境要求下的生物
中，包含洗滌、造紙或污水處理等行業，還可用于釀造等食品行業。
3、本專利技術還提供了上述突變體d180s的編碼基因，該編碼基因的核苷酸序列如seqid?no.2所示。
4、本專利技術還提供了一種包含上述編碼基因的重組質粒，該重組質粒選自pet系列的載體，優選pet-22b(+)。
5、本專利技術還提供了一種包含上述編碼基因的重組菌，該重組菌選自大腸桿菌，優選自bl21(de3)。
6、本專利技術提供的嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s，解決了野生β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶低溫活性差以及加鹽調控活性不敏感的問題，具有以下優點：
7、本專利技術提供的突變體d180s與重組野生β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶opt-hj5nagnc相比，突變體d180s的熱活性以及在不同濃度鹵素鹽和nano3中的活性發生了改變。突變體d180s最適溫度為5℃，在低溫條件下活性提高，此外，鹵素鹽和nano3對該酶的酶活有激活作用。純化的重組野生酶opt-hj5nagnc的最適溫度為45℃，在0℃僅有2.3％的酶活；突變體d180s的最適溫度為5℃，在0℃還有78.41％的酶活。在終濃度為0.1-3.5mnacl、nabr、nano3和0.1-1m?nai中分別進行酶促反應，重組野生酶opt-hj5nagnc的活性均受到不同程度的抑制，d180s的活性被不同程度地激活，其中nacl和nabr對d180s的激活作用最明顯：在不含鹽的體系中，d180s的比活力約為2.26u/mg，在終濃度為1.5m的nacl中，d180s的比活力最高，活性提高約234倍；在終濃度為0.5m的nabr體系中，d180s的比活力最高，活性提高約232倍；在終濃度為0.7m?nano3中，d180s的比活力最高，活性提高約66倍；在終濃度為0.3m?nai中，d180s的比活力最高，活性提高約29倍。此外，在終濃度為0.4m的naf體系中，d180s的比活力最高，活性提高約44倍。本專利技術中所測的5種陰離子對d180s的激活作用大小為cl->br->no3->f->i-。
8、本專利技術提供的突變體d180s可應用于低溫含鹽環境要求下的生物
，尤其可應用于食品、釀造、洗滌、造紙、污水處理等行業，應用價值顯著。在食品行業，嗜鹽酶可應用于海產品加工、泡菜和醬汁制作以及咸味食品中，另外工業上還用嗜鹽酯酶和脂肪酶合成不飽和脂肪酸和短鏈脂肪酸作為膳食補充劑；在釀造行業，嗜鹽酶可應用于高鹽稀態醬油發酵，發酵出來的醬油顏色好、風味突出、鮮香味足；在洗滌行業，nacl是洗滌劑的一種成分，應用在洗滌劑中的酶能在含鹽條件下保持活性才能發揮作用，來源于aspergillusniger?mh079049.1的嗜鹽脂肪酶已經被用到洗滌劑配方中(alabdalallah?etal.scientific?reports,2021,11(1):19670)；在污水處理行業，nacl是高鹽污水尤其是高鹽食品加工廢水中的主要無機鹽，在高鹽污水中添加嗜鹽酶，可以提高污水的生物處理效率。
【技術保護點】
1.一種嗜冷的鹽激活β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體D180S，其特征在于，該突變體D180S的氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，該突變體D180S在0℃有78.41％的酶活，其活性可以被鹵素鹽和NaNO3激活。
2.如權利要求1所述嗜冷的鹽激活β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體D180S的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
3.包含如權利要求2所述編碼基因的重組質粒。
4.根據權利要求3所述的重組質粒，其特征在于，所述的重組質粒選自pET-22b(+)。
5.包含如權利要求2所述編碼基因的重組菌。
6.根據權利要求5所述的重組菌，其特征在于，所述的重組菌選自大腸桿菌BL21(DE3)。
7.如權利要求1所述嗜冷的鹽激活β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體D180S在低溫含鹽環境要求下的生物技術領域中的應用。
8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，所述的生物技術領域包含食品、洗滌、造紙或污水處理行業。
9.根據權利要求8所述的應用，其特征在
...【技術特征摘要】
1.一種嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s，其特征在于，該突變體d180s的氨基酸序列如seq?id?no.1所示，該突變體d180s在0℃有78.41％的酶活，其活性可以被鹵素鹽和nano3激活。
2.如權利要求1所述嗜冷的鹽激活β-n-乙酰氨基葡萄糖苷酶突變體d180s的編碼基因，其特征在于，所述編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no.2所示。
3.包含如權利要求2所述編碼基因的重組質粒。
4.根據權利要求3所述的重組質粒，其特征在于，所述的重組...
【專利技術屬性】
技術研發人員：張蕊，寧娟，周峻沛，黃遵錫，吳倩，楊樂，
申請(專利權)人：云南師范大學，
類型：發明
國別省市：
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