【技術實現步驟摘要】
本專利技術涉及rna的三維結構模型搭建，特別涉及一種確定rna的三維結構中的解決rna異質性的方法、一種確定rna的三維結構的方法及一種確定rna的三維結構的方法的應用。
技術介紹
1、rna參與各種基本生物過程，如催化、轉錄調控、翻譯和信號通路調節。rna的三維結構主要決定了它們的功能，例如，核酶形成緊湊的核心結構來催化反應；核糖開關通過感知不同的配體和環境變化來調節基因表達；長鏈非編碼rna(lncrna)折疊成特定結構并與蛋白質相互作用以執行其功能。
2、在體外或體內進行功能時，結構化的rna可能會經歷大的構象變化，單個核苷酸也可能在其功能執行過程中發生局部的動態變化。這使得制備均質rna樣本以進行結構測定變得復雜。此外，傳統的結構生物學技術，如x射線晶體學、核磁共振(nmr)和冷凍電鏡單顆粒分析(cryo-em?spa)，在處理不同rna的異質性時都有其技術限制，這些限制共同對rna的高分辨率三維結構分析提出了很大挑戰。x射線晶體學通常需要大量rna樣本，且rna的總體結構異質性要盡可能小，以促進分子在晶體生長過程中的堆積和晶格形成。有時可以觀察到結構域的構象變化。nmr主要用于研究小型rna(平均大小為30個核苷酸(30-nt))在低能穩態和高能激發態下的個別核苷酸和堿基互變現象。cryo-em?spa可以在接近原子分辨率下解析較大rna及其復合物的整體構象變化和核苷酸及離子的局部動態。然而，到目前為止，研究的rna的最低分子大小為88-nt，并且大多數rna冷凍電鏡結構解析的分辨率在中等到低分辨率范圍，限
3、現有的方法雖然使rna結構的確定變得更加高效，但與蛋白質相比，rna結構在蛋白質數據庫(protein?data?bank,pdb)和電子顯微鏡數據庫(electronic?microscopydata?bank,emdb)中的代表性仍然很低，這可能是rna結構預測準確性低于蛋白質的主要原因之一。這突顯了需要一種系統化的方法和流程，以便廣泛應用于功能明確的rna的冷凍電鏡結構確定。即便是對于更簡化的蛋白質冷凍電鏡結構確定，樣本準備和玻璃化中的許多變量也需要迭代優化，通常需要操作者的專業知識和經驗。這使得現有的方法難以標準化，因為其效果因樣本而異。
4、上述
技術介紹
是為了便于理解本專利技術，并非是申請本專利技術之前已向普通公眾公開的公知技術。
技術實現思路
1、針對上述缺陷，本專利技術提供一種確定rna的三維結構中的rna體外轉錄和純化及rna折疊方法，其旨在改善
技術介紹
提到的至少一種問題。
2、本專利技術方法是為那些通過形成三維結構來執行功能的rna開發的。對這些具有明確功能的rna進行結構分析可以闡明它們的分子機制。本專利技術方法確定不同功能、不同分子量的rna的冷凍電鏡(cryo-em)結構，涵蓋了廣泛的條件。
3、本專利技術方法“ribosolve”，它提供了一條快速的冷凍電鏡指導的rna結構確定流程，以及其他方法，如寡聚體和高階組裝以促進冷凍電鏡分析，以及利用大型支架rna以實現小rna的冷凍電鏡結構確定。
4、技術方案是：一種確定rna的三維結構中的解決rna異質性的方法，包括以下步驟：
5、s3，純化折疊后的rna接著被冷凍制樣玻璃化，并在冷凍電鏡下進行評估，以獲得具有最佳冰厚度和均勻粒子大小及分布的載網；
6、s4，載網進行小量數據收集，數據處理在二維(2d)分類完成后暫停以進行初步評估，初步評估如果具有明顯的rna特征，則進入大規模冷凍電鏡數據收集和后續數據處理以解決rna異質性，如果不具有明顯的rna特征，則需要嘗試不同的rna制備和/或玻璃化條件獲得優化的rna樣本并重新進行小量數據收集，直到具有明顯rna特征，再進行大規模冷凍電鏡數據收集后再進入數據處理以解決rna異質性；
7、s5，大多數rna在執行功能時會經歷構象變化，標準的冷凍電鏡數據處理流程和三維分類算法結合更有效地分離構象變化。
8、本專利技術還提供一種確定rna的三維結構中的解決rna異質性的方法。
9、技術方案是：一種確定rna的三維結構中的解決rna異質性的方法，包括以下步驟：
10、s3，rna樣本玻璃化、冷凍電鏡觀察和數據收集；
11、s4，數據處理以解決rna異質性。
12、進一步地，s3包括以下步驟：
13、s19，在最佳條件下準備所需數量的rna樣品，以便進行玻璃化和冷凍電子顯微鏡分析；
14、s20，將mark?iv?vitrobot的溫度和相對濕度設置為4℃和100％，在室內和冷凍劑容器中組裝濾紙以進行玻璃化；
15、s21，選擇合適類型的載網并進行輝光放電，其中銅載網主要用于篩選階段，當最終濃度低于1μm且rna大于100kda時，使用支持膜；
16、s22，將載網裝載到vitrobot上，在載網上添加2-3μl的樣品，使用濾紙吸去多余樣品并注入冷凍劑，將載網轉移到液氮預冷的載網盒中；
17、s23，將自動載網裝入預冷的盒子中，將盒子轉移到充滿液氮的nanocab中，然后將盒子對接到顯微鏡上，檢查顯微鏡是否準備好進行成像；
18、s24，打開epu，選擇atlas模式以獲得載網上冰分布的概覽；將樣品臺移動到感興趣的區域，并在gridsquare模式下獲取圖像；找到同心高度，將樣品臺移動到具有適當冰層的孔中，進入hole/eucentricheight模式；在data?acquisition模式下收集cryo-em圖像；
19、s25，如果載網不理想且不適合數據收集，卸下該載網并重復s24以篩選下一個載網；
20、s26，完成所有自動載網的篩選后，如果冰層厚度不理想，重復s20-s25，以篩選載網、輝光放電時間和vitrobot參數，直到獲得最佳的冰層厚度；如果rna樣品狀態不適合數據收集，則篩選體外轉錄和rna折疊中的變量，直到觀察到適合數據收集的最佳顯微照片；
21、s27，在epu中激活“冰層過濾器”，以根據圖像強度確定的冰層厚度選擇孔；
22、s28，根據epu方案設置自動數據收集，檢查顯微鏡和相機設置，以確保數據收集順利進行。
23、進一步地，s4包括以下步驟：
24、s29，導入所有冷凍電鏡照片，并使用motioncor2執行“漂移校正motioncorrection”，將“number?of?patches?x,y”設置為“5,5”，并將“其他motioncor2參數”設置為“-iter?10”，每幀的劑量相應提供，其余參數保持默認；
25、s30，使用ctffind4在默認設置下執行“襯度轉移函數估計”，但將“amount?ofastigmatism”設置為對比度環超出的顯微照片進行視覺檢查并選擇；
26、s31，在cryosparc中使用blob?本文檔來自技高網...
【技術保護點】
1.一種確定RNA的三維結構中的解決RNA異質性的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.一種確定RNA的三維結構中的解決RNA異質性的方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的確定RNA的三維結構中的解決RNA異質性的方法，其特征在于，S3包括以下步驟：
4.根據權利要求2所述的確定RNA的三維結構中的解決RNA異質性的方法，其特征在于，S4包括以下步驟：
5.根據權利要求4所述的確定RNA的三維結構中的解決RNA異質性的方法，其特征在于，所述在cryoSPARC中使用Blob?picker包括以下步驟：
6.根據權利要求4所述的確定RNA的三維結構中的解決RNA異質性的方法，其特征在于，所述在Relion中使用基于參考的模板匹配包括以下步驟：
7.根據權利要求4所述的確定RNA的三維結構中的解決RNA異質性的方法，其特征在于，所述在EMAN2中使用基于參考的CNN顆粒拾取包括以下步驟：
8.根據權利要求4所述的確定RNA的三維結構中的解決RNA異質性的方法，其特征在于，S39中，
9.一種確定RNA的三維結構的方法，其特征在于，所述方法包括：
10.一種權利要求9所述的確定RNA的三維結構的方法的應用，其特征在于，應用于形成三維結構的70-nt或更大的RNA。
...【技術特征摘要】
1.一種確定rna的三維結構中的解決rna異質性的方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.一種確定rna的三維結構中的解決rna異質性的方法，其特征在于，包括以下步驟：
3.根據權利要求2所述的確定rna的三維結構中的解決rna異質性的方法，其特征在于，s3包括以下步驟：
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5.根據權利要求4所述的確定rna的三維結構中的解決rna異質性的方法，其特征在于，所述在cryosparc中使用blob?picker包括以下步驟：
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