【技術(shù)實現(xiàn)步驟摘要】
本專利技術(shù)涉及合成生物學(xué)和代謝工程化，特別涉及一種微生物基因組插入位點的篩選方法和應(yīng)用。
技術(shù)介紹
1、相較于傳統(tǒng)的化學(xué)與酶促方法，在微生物中引入特定基因并通過發(fā)酵產(chǎn)生大量產(chǎn)品的方式更為簡單且經(jīng)濟高效。過去已經(jīng)開發(fā)了許多方法來轉(zhuǎn)化細(xì)胞（例如酵母或細(xì)菌）的基因組。但是傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法依賴于在細(xì)胞基因組內(nèi)隨機插入基因，這可能會終斷內(nèi)源性狀的表達(dá)、或抑制轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中插入基因表達(dá)等。因此，細(xì)胞的靶向基因組修飾是應(yīng)用和基礎(chǔ)研究的首選方式，將轉(zhuǎn)基因靶向插入細(xì)胞基因組中的特定位置將有效改善轉(zhuǎn)基因事件的質(zhì)量，降低相關(guān)成本并為制造轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品提供新方法。
2、相較于傳統(tǒng)生長于溫和環(huán)境下的微生物（例如大腸桿菌）作為底盤細(xì)菌，在極端環(huán)境中生存的微生物，特別是能進(jìn)行無需滅菌開放式發(fā)酵的嗜鹽單胞菌，能夠使發(fā)酵工業(yè)實現(xiàn)開放式生產(chǎn)，大幅度減低生產(chǎn)成本。但是微生物尤其是嗜鹽單胞菌作為非模式生物，目前對其研究和了解的還比較少，尤其是基因編輯工具的研究和進(jìn)展很少，這限制了研究者對鹽單胞菌進(jìn)行基因操作和代謝物的生產(chǎn)。所以，開發(fā)微生物尤其是嗜鹽單胞菌基因組中用于插入異源或外源序列的插入位點及其方法顯得尤為重要。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、針對現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本專利技術(shù)提出了一種微生物基因組插入位點的篩選方法和應(yīng)用。本專利技術(shù)通過生物信息學(xué)與轉(zhuǎn)錄組測序?qū)ξ⑸锏幕蜷g間隔區(qū)域進(jìn)行篩選，并利用構(gòu)建熒光重組載體驗證基因間間隔區(qū)域基因組的表達(dá)強度及穩(wěn)定性，得到的基因間間隔區(qū)域為構(gòu)建重組微生物尤其是嗜鹽單胞菌基因提供了有力的工具
2、本專利技術(shù)提供了一種微生物插入位點的篩選方法，所述插入位點為基因間間隔區(qū)域，所述篩選方法包括以下步驟：
3、（1）篩除長度小于200?bp及含有編碼trna、rrna、srna、trf的基因間間隔區(qū)域；
4、（2）篩除含預(yù)測啟動子序列的基因間間隔區(qū)域，通過啟動子預(yù)測找出位置在igr上的啟動子，若上游基因方向為“-”或下游基因方向為“+”，則在igr所對應(yīng)的上游或下游額外減去25?bp；
5、（3）篩除上游基因啟動子中的-35區(qū)距下游基因啟動子中的-35區(qū)的距離小于等于50?bp的基因間間隔區(qū)域；
6、（4）篩除上游基因或下游基因的啟動子的-35區(qū)的第1-50?bp位點中含有大腸桿菌基因組轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的基因間間隔區(qū)域；
7、（5）篩除上游基因或下游基因轉(zhuǎn)錄活性不在所有基因轉(zhuǎn)錄活性的前50%的基因間間隔區(qū)域，得到所述插入位點；
8、（6）分別構(gòu)建兩個熒光蛋白質(zhì)粒，第一熒光蛋白質(zhì)粒包含熒光蛋白和步驟（5）所述的插入位點，第二熒光蛋白質(zhì)粒包含第一熒光蛋白質(zhì)粒中的熒光蛋白；
9、（7）將步驟（6）所述的第一熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)入微生物中，得到含有第一熒光蛋白的重組細(xì)菌；
10、（8）將步驟（6）所述的第二熒光蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)入微生物中，得到含有第二熒光蛋白的重組細(xì)菌；
11、（9）培養(yǎng)發(fā)酵步驟（7）和（8）得到的重組細(xì)菌，進(jìn)行熒光測定。
12、通過以上篩選方法，本專利技術(shù)在嗜鹽單胞菌中篩選到了21個插入位點（基因間間隔區(qū)域），其核苷酸序列如seq?id?no.1、seq?id?no.2、seq?id?no.3、seq?id?no.4、seq?idno.5、seq?id?no.6、seq?id?no.7、seq?id?no.8、seq?id?no.9、seq?id?no.10、seq?idno.11、seq?id?no.12、seq?id?no.13、seq?id?no.14、seq?id?no.15、seq?id?no.16、seq?idno.17、seq?id?no.18、seq?id?no.19、seq?id?no.20、seq?id?no.21中的任意一種。其中，所述基因間間隔區(qū)域指嗜鹽單胞菌基因組上的基因間間隔區(qū)域；其中，所述重組嗜鹽單胞菌指在嗜鹽單胞菌基因組上的基因間間隔區(qū)域插入外源基因，所述外源基因包括但不限于：熒光蛋白、p34hb合成基因簇。優(yōu)選地，所述基因間間隔區(qū)域的核苷酸序列為seq?id?no.9、seq?id?no.10、seq?id?no.15中的任意一種。
13、進(jìn)一步的，步驟（2）中通過鹽濃度、尿素濃度或發(fā)酵周期進(jìn)行篩選。
14、進(jìn)一步的，所述鹽濃度為10-100?g/l氯化鈉。優(yōu)選地，所述鹽濃度為60?g/l氯化鈉。
15、進(jìn)一步的，所述尿素濃度為0-10?g/l尿素。優(yōu)選地，所述尿素濃度為3.6?g/l尿素。
16、進(jìn)一步的，所述發(fā)酵周期為12-72?h。優(yōu)選地，所述發(fā)酵周期為9-30?h。
17、進(jìn)一步的，所述第一熒光蛋白質(zhì)粒和第二熒光蛋白質(zhì)粒中的熒光蛋白通過啟動子調(diào)控。
18、進(jìn)一步的，所述啟動子為porin58、porin140、porin141中的任意一種。其中，porin58、porin140、porin141代表不同強度的啟動子，對三種啟動子的強度進(jìn)行對比，強度最強的啟動子為porin141，其次為porin140，最后為porin58。
19、本專利技術(shù)還提供了一種基因間間隔區(qū)域在嗜鹽單胞菌中穩(wěn)定合成p34hb的應(yīng)用，包括以下步驟：
20、（1）將p34hb合成基因簇插入所述基因間間隔區(qū)域，得到p34hb合成基因簇整合模塊，將p34hb合成基因簇整合模塊插入質(zhì)粒中，得到含有p34hb合成基因簇的整合質(zhì)粒；
21、其中，所述p34hb合成基因簇為aldd-dhat-orfz，所述aldd-dhat-orfz的核苷酸序列如seq?id?no.274所示；
22、（2）將步驟（1）所述含有p34hb合成基因簇的整合質(zhì)粒與嗜鹽單胞菌進(jìn)行接合，得到含有p34hb合成基因簇的重組嗜鹽單胞菌，培養(yǎng)發(fā)酵所述重組嗜鹽單胞菌。
23、優(yōu)選地，所述基因間間隔區(qū)域的核苷酸序列為seq?id?no.9、seq?id?no.10、seqid?no.15中的任意一種。
24、本專利技術(shù)還提供了一種整合質(zhì)粒，所述整合質(zhì)粒包含所述基因間間隔區(qū)域的核苷酸序列中的任意一種。
25、本專利技術(shù)中使用的halomonas?sp.?ly01菌株已公開在專利cn116396886a中，保藏號為gdmcc?no:62635；halomonas?sp.?ly03菌株已公開在專利cn116970538a中，保藏號為gdmcc?no.?63382。
26、綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本專利技術(shù)達(dá)到了以下技術(shù)效果：
27、本專利技術(shù)的篩選方法篩選出的基因組插入位點具有較強的表達(dá)強度和穩(wěn)定性，其中不同插入位點表達(dá)強度具有多樣性，可通過選擇不同基因組插入位點來改變基因的表達(dá)強度，避免了使用不同強度的啟動子來改變質(zhì)粒表達(dá)強度的方法。同時，所述插入位點能夠為外源基因在微生物尤其是嗜鹽單胞菌體內(nèi)的穩(wěn)定整合及表達(dá)提供了有力工具。
本文檔來自技高網(wǎng)...【技術(shù)保護點】
1.一種微生物基因組插入位點的篩選方法，其特征在于，所述插入位點為基因間間隔區(qū)域，所述篩選方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述微生物包括但不限于嗜鹽單胞菌、大腸桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟（2）中通過鹽濃度、尿素濃度或發(fā)酵周期進(jìn)行篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述鹽濃度為10-100?g/L氯化鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述尿素濃度為0-10?g/L尿素。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述發(fā)酵周期為12-72?h。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述第一熒光蛋白質(zhì)粒和第二熒光蛋白質(zhì)粒中的熒光蛋白通過啟動子調(diào)控。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的篩選方法，其特征在于，所述啟動子為porin58、porin140、porin141中的任意一種。
9.一種如權(quán)利要求1-8任一項所述的篩選方法得到的插入位點在嗜鹽單胞菌中穩(wěn)定合成P34HB的應(yīng)用，其特征在于
10.一種整合質(zhì)粒，其特征在于，所述整合質(zhì)粒包含權(quán)利要求1-8任一項所述的篩選方法得到的插入位點的核苷酸序列中的任意一種。
...【技術(shù)特征摘要】
1.一種微生物基因組插入位點的篩選方法，其特征在于，所述插入位點為基因間間隔區(qū)域，所述篩選方法包括以下步驟：
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述微生物包括但不限于嗜鹽單胞菌、大腸桿菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，步驟（2）中通過鹽濃度、尿素濃度或發(fā)酵周期進(jìn)行篩選。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述鹽濃度為10-100?g/l氯化鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征在于，所述尿素濃度為0-10?g/l尿素。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的篩選方法，其特征...
【專利技術(shù)屬性】
技術(shù)研發(fā)人員：葉健文，林藝娜，陳婷婷，李浩，呂金艷，司徒衛(wèi)，余柳松，
申請(專利權(quán))人：珠海麥得發(fā)生物科技股份有限公司，
類型：發(fā)明
國別省市：
還沒有人留言評論。發(fā)表了對其他瀏覽者有用的留言會獲得科技券。