【技術實現步驟摘要】
本專利技術屬于分子生物學dna遺傳標記及微生物學領域，具體涉及一種可以聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法。
技術介紹
1、近年來，微生物在宿主生長發育過程中的重要性逐漸凸顯，其影響宿主的核心功能，如生長、發育、免疫、營養和繁殖等。而微生物組成與豐度除受環境影響外，同時也受宿主遺傳背景的影響。已有研究報道微生物組成在個體之間顯示出穩定的差異，不同性別之間的微生物群落特征也不相同，種群中不同基因型具備不同的微生物群落特征。這些結果均表明宿主遺傳對微生物組成的影響。因此全息組學分析，即宿主與微生物的共同聯合分析已成為微生物與宿主生態和進化的研究熱點。
2、目前全息組學研究采用的策略主要以16s擴增子測序技術結合基因分型技術，如全基因組重測序、簡化基因組測序（rad/2b-rad）等。16s擴增子測序技術為目前微生物分析的主流技術之一，然而其僅能獲得細菌的遺傳信息，真菌和病毒的遺傳多樣性無法獲得。而且為了獲得宿主的遺傳信息，額外的宿主測序分庫仍需構建。因此該策略需要分別獲取用于宿主基因分型和微生物分析的組織材料，并通過兩次提取和兩次建庫才能實現宿主和微生物信息的獲得，過程復雜，流程繁瑣。分別制備文庫及單獨測序所需的成本也較高。
3、除上述策略外，一種比16s擴增子測序更全面的方法是鳥槍法測序。它可以對樣品內所有微生物的基因組進行測序，還可進行功能分析和基因組組裝。現在通過鳥槍法測序文庫分析多種生物信息的方法已經建立，可以從一個鳥槍法測序文庫實現全息組學分析。然而，鳥槍法需要對測序文庫進行深度覆蓋，這意
4、除此之外，上述兩種策略對材料量的巨大需求使得其在體型較小的生物，如某些貝類、蝦類等中動態追蹤宿主與微生物的變化尤為困難。因此如何低成本的實現動態全息組學追蹤是本領域技術人員亟需解決的問題。
技術實現思路
1、鑒于以上現有技術的不足，本專利技術提供一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法。
2、本專利技術的技術方案如下：
3、一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，包括以下步驟：
4、（1）根據宿主基因組序列、微生物基因組序列及iib型限制性內切酶的識別序列，提取宿主及微生物的電子酶切標簽，建立宿主-微生物的iib酶切標簽數據庫，并分別獲取微生物在不同分類級上特異且宿主也特異的序列，建立宿主-微生物iib酶切的全息組學數據庫；
5、（2）混合dna的提取：取含有混合dna的材料進行混合dna的提取；
6、（3）使用16s?rdna可變區域v4-5區的引物對515f和907r對步驟（2）獲得的混合dna進行擴增，若在400bp和600bp處出現條帶則判定合格；
7、所述515f的核苷酸序列為：5'-gtgccagcagcggtaa?(seq?id?no:1)?；
8、所述907r的核苷酸序列為：5'-ccgtcaattcttgtagtttt?(seq?id?no:2)?；
9、16s其他區域的引物僅能與細菌的基因組序列結合，有效擴增細菌條帶，無法與真核生物基因組序列結合。因此僅能鑒定微生物dna的存在，而無法鑒定真核生物dna是否存在。而本專利技術所用的引物不僅可擴增細菌的v4-5區，片段長度約為400bp；與扇貝和對蝦基因組序列也有結合位點，可擴增宿主的基因組片段，長度約為600bp。
10、（4）用步驟(3)判定合格的混合dna樣品構建2brad/miso-rad測序文庫并進行高通量測序；
11、（5）對步驟(4)獲得的測序數據進行預處理，去除低質量數據，提取含有酶切位點的序列，將提取的測序數據中的酶切片段比對至步驟（1）構建的數據庫，然后分別進行宿主與微生物分析。
12、優選的，步驟（1）包括：
13、根據宿主基因組序列、微生物基因組序列及iib型限制性內切酶的識別序列，對已知所有微生物基因組及所分析的宿主基因組同時進行電子酶切，獲得所有微生物及宿主的電子酶切標簽，建立宿主-微生物的iib酶切標簽數據庫；對所述酶切標簽，在微生物物種的不同分類級別進行相互比對，并同時與宿主的酶切標簽進行相互比對，篩選出只屬于某一物種而與其他物種無重復的酶切片段，以此建立宿主-微生物iib酶切的全息組學數據庫。
14、優選的，步驟（2）中，所述含有混合dna的材料包括擦拭組織后的棉簽、糞便、腸道或幼蟲材料；所述組織包括鰓絲、外套膜、皮膚、口腔。
15、優選的，所述組織為鰓絲或口腔。
16、優選的，步驟（4）中，所述構建2brad/miso-rad?測序文庫包括構建單標簽文庫或構建多個標簽串聯文庫。
17、優選的，步驟（4）包括：
18、用iib型限制性內切酶酶切步驟（2）中的混合dna，根據使用的iib酶選擇相應的接頭進行連接，通過pcr富集連接片段，pcr產物回收純化，加條形碼序列標記進行pcr擴增。
19、優選的，所述iib型限制性內切酶包括alfi、aloi、baei、bcgi、bpli、bsaxi、bslfi、cspci、fali、hin4i或ppii。
20、優選的，步驟(5）包括：
21、對步驟(4)獲得的測序數據進行預處理，按照序列不含n、序列80％以上堿基的質量值>20原則去除低質量數據，提取含有酶切位點的序列，將提取的測序數據中的酶切片段比對至步驟（1）構建的宿主-微生物iib酶切的全息組學數據庫；比對至數據庫中的宿主序列的數據進行全基因組分型，比對至微生物基因組的數據，則進行微生物組成及豐度分析。
22、優選的，所述宿主包括貝類或蝦類。
23、優選的，所述宿主包括蝦夷扇貝。
24、本專利技術的有益效果：
25、（1）可低成本、高效率的通過單文庫實現宿主與微生物的聯合分析：在相同測序深度的情況下，本技術實現宿主和微生物聯合分析的成本約為鳥槍法測序的5%，為擴增子測序與全基因組基因分型技術聯用的80%。除此之外，本技術僅需一次取材，一次dna提取，構建一個測序文庫即可實現宿主及微生物同步聯合分析；并且所需數據量少，對存儲空間及計算資源占用少，具備標準化分析流程，可實現較高效率的數據分析。
26、（2）可實現動態全息組學的追蹤。本技術所需dna入口量極低，并且對降解程度較高的dna也仍然適用。因此無需對生物進行破壞性取材，即便是對體型較小的某些水產生物而言，通過擦拭組織獲得的材料量即可用于建庫分析。
27、（3）本技術提取的dna為混合dna，既包含了宿主遺傳信息也同時包含微生物遺傳信息，因此可獲得不同階段或不同環境下宿主與微生物dna的相對比例信息。
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1.一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（1）包括：
3.如權利要求1所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（2）中，所述含有混合DNA的材料包括擦拭組織后的棉簽、糞便、腸道或幼蟲材料；所述組織包括鰓絲、外套膜、皮膚或口腔。
4.如權利要求3所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，所述組織為鰓絲或口腔。
5.?如權利要求1所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（4）中，所述構建2bRAD/Miso-RAD?測序文庫包括構建單標簽文庫或構建多個標簽串聯文庫。
6.如權利要求1所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（4）包括：
7.如權利要求6所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，所述IIB型限制性內切酶包括Alf
8.如權利要求1所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟(5）包括：
9.如權利要求1~8任一項所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，所述宿主包括貝類或蝦類。
10.如權利要求9所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，所述宿主包括蝦夷扇貝。
...【技術特征摘要】
1.一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，包括以下步驟：
2.如權利要求1所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（1）包括：
3.如權利要求1所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（2）中，所述含有混合dna的材料包括擦拭組織后的棉簽、糞便、腸道或幼蟲材料；所述組織包括鰓絲、外套膜、皮膚或口腔。
4.如權利要求3所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，所述組織為鰓絲或口腔。
5.?如權利要求1所述的一種聯合解析宿主及其共存微生物的簡化基因組分析方法，其特征在于，步驟（4）中，所述構建2brad/miso-rad?測序文庫包括構建單標簽文庫或構建多個標簽串聯文...
【專利技術屬性】
技術研發人員：王師，劉平平，馬岑，徐暢，張天琦，呂佳，張玲玲，胡景杰，包振民，
申請(專利權)人：中國海洋大學三亞海洋研究院，
類型：發明
國別省市：
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